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目的
建立β淀粉样蛋白25-35(Amyloidβ-proteinFragment25-35,Aβ25-35)诱导的小鼠小胶质细胞BV-2损伤模型,作为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD )的细胞模型,探讨六味地黄丸含药血清(Liuweidihuang serum,LWDHS)干预后相关炎症因子的表达情况及可能分子作用机制。
方法
1将老化好的Aβ25-35溶液设定成不同的浓度(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)作用于BV-2细胞,继续培养24小时,MTT法检测细胞活性,选取最适浓度建立BV-2损伤模型作为AD细胞模型。
2制备六味地黄丸含药血清,设定成不同的浓度(2.5%、5%、10%、20%)作用于BV-2细胞,设定同样浓度的空白血清作用于BV-2细胞作为平行对照,继续培养24小时,MTT法检测细胞活性,筛选出药物最适浓度,对阿尔茨海默病细胞模型进行干预。
3实验分组:依据前期MTT筛选的结果将实验分为四组,依次为空白对照组、Aβ25-35组、LWDHS+Aβ25-35组和LWDHS组。其中空白对照组加入10%空白血清;Aβ25-35组加入10%空白血清和终浓度40μmol/L的Aβ25-35溶液;LWDHS+Aβ25-35组加入10%六味地黄丸含药血清和终浓度40μmol/L的Aβ25-35溶液;LWDHS组加入10%六味地黄丸含药血清。
4酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-1β的含量:每组药物作用于BV-2细胞后,收集细胞上清液,检测各组的细胞上清液中IL-1β的含量。
5细胞免疫荧光染色法检测TBP-2和S100A9的表达:每组药物作用于BV-2细胞后,倒置荧光显微镜下观察各组TBP-2和S100A9的表达情况。
6qRT-PCR法检测相关基因表达:每组药物作用于BV-2细胞后提取各组中的RNA,qRT-PCR法检测TBP-2、S100A9和IL-1βmRNA的表达水平。
7蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测相关蛋白水平:每组药物作用于BV-2细胞后提取蛋白,免疫印迹法检测TBP-2、NF-κB及IL-1β蛋白的表达情况。
结果
1将不同浓度的Aβ25-35(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)分别作用于BV-2细胞,MTT法检测24小时的细胞活性,每个浓度组的细胞活性均降低,并在一定范围内呈现浓度依赖性,随着Aβ25-35浓度的不断增加,细胞活性逐渐下降,其中当Aβ25-35为40μmol/L时差异非常显著(P<0.01),选取该浓度建立BV-2损伤模型作为AD细胞模型。
2分别将不同浓度的空白血清、LWDHS(2.5%、5%、10%、20%)作用于BV-2细胞,MTT法检测24小时的细胞活性,与空白血清各浓度组相比,LWDHS各浓度组的细胞活性均有所升高,其中10%、20%LWDHS组与10%、20%空白血清组相比有差异(P<0.05),细胞相对活性升高,LWDHS10%、20%组之间比较差异性不明显(P>0.05)。综合实验考虑选取10%浓度LWDHS作用于BV-2细胞模型,并将含有10%的LWDHS直接作用于BV-2细胞的组别设为LWDHS组。
3根据前期实验依次分组为空白对照组、Aβ25-35组、LWDHS+Aβ25-35组和LWDHS组,MTT法检测24小时的结果显示:与空白对照组相比,Aβ25-35组、LWDHS+Aβ25-35组细胞活性降低,差异有统计学意义(P<0.05);与Aβ25-35组相比,LWDHS+Aβ25-35组细胞活性有所升高(P<0.05)。
4ELISA实验结果显示:与空白对照组相比,Aβ25-35组IL-1β的分泌水平显著增高(P<0.01);与Aβ25-35组相比,LWDHS+Aβ25-35组的IL-1β分泌水平下降(P<0.05)。
5细胞免疫荧光结果显示:与空白对照组相比,Aβ25-35组BV-2细胞出现明显凋亡,细胞核固缩,细胞质荧光高表达;与Aβ25-35组相比,LWDHS+Aβ25-35组的细胞也出现凋亡,核固缩,甚至呈月牙状,细胞质荧光强度降低;LWDHS组与空白对照组比较,细胞核形态较完整,细胞质荧光强度减弱,无明显差异。
6qRT-PCR实验结果显示:与空白对照组相比,Aβ25-35组的TBP-2、S100A9、IL-1βmRNA水平提高(P<0.05或P0.01);与Aβ25-35组相比,LWDHS+Aβ25-35组的TBP-2、S100A9、IL-1βmRNA水平表达有下降趋势(P0.05)。
7Westernblot实验结果显示:与空白对照组相比,Aβ25-35组的TBP-2、NF-κBp65、IL-1β表达均上调(P<0.05);与Aβ25-35组相比,LWDHS+Aβ25-35组的TBP-2、NF-κBp65、IL-1β表达有所下调(P<0.05)。
结论
LWDHS对Aβ25-35损伤的BV-2细胞活性有一定保护作用,能够下调Aβ25-35刺激后炎症因子TBP-2、S100A9、NF-κBp65、IL-1β的表达水平,可能是通过调节TBP-2/S100A9炎症通路减少相关炎症因子的释放,从而降低细胞炎性损伤,保护神经元,起到防治阿尔茨海默病的作用。
建立β淀粉样蛋白25-35(Amyloidβ-proteinFragment25-35,Aβ25-35)诱导的小鼠小胶质细胞BV-2损伤模型,作为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD )的细胞模型,探讨六味地黄丸含药血清(Liuweidihuang serum,LWDHS)干预后相关炎症因子的表达情况及可能分子作用机制。
方法
1将老化好的Aβ25-35溶液设定成不同的浓度(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)作用于BV-2细胞,继续培养24小时,MTT法检测细胞活性,选取最适浓度建立BV-2损伤模型作为AD细胞模型。
2制备六味地黄丸含药血清,设定成不同的浓度(2.5%、5%、10%、20%)作用于BV-2细胞,设定同样浓度的空白血清作用于BV-2细胞作为平行对照,继续培养24小时,MTT法检测细胞活性,筛选出药物最适浓度,对阿尔茨海默病细胞模型进行干预。
3实验分组:依据前期MTT筛选的结果将实验分为四组,依次为空白对照组、Aβ25-35组、LWDHS+Aβ25-35组和LWDHS组。其中空白对照组加入10%空白血清;Aβ25-35组加入10%空白血清和终浓度40μmol/L的Aβ25-35溶液;LWDHS+Aβ25-35组加入10%六味地黄丸含药血清和终浓度40μmol/L的Aβ25-35溶液;LWDHS组加入10%六味地黄丸含药血清。
4酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-1β的含量:每组药物作用于BV-2细胞后,收集细胞上清液,检测各组的细胞上清液中IL-1β的含量。
5细胞免疫荧光染色法检测TBP-2和S100A9的表达:每组药物作用于BV-2细胞后,倒置荧光显微镜下观察各组TBP-2和S100A9的表达情况。
6qRT-PCR法检测相关基因表达:每组药物作用于BV-2细胞后提取各组中的RNA,qRT-PCR法检测TBP-2、S100A9和IL-1βmRNA的表达水平。
7蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测相关蛋白水平:每组药物作用于BV-2细胞后提取蛋白,免疫印迹法检测TBP-2、NF-κB及IL-1β蛋白的表达情况。
结果
1将不同浓度的Aβ25-35(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)分别作用于BV-2细胞,MTT法检测24小时的细胞活性,每个浓度组的细胞活性均降低,并在一定范围内呈现浓度依赖性,随着Aβ25-35浓度的不断增加,细胞活性逐渐下降,其中当Aβ25-35为40μmol/L时差异非常显著(P<0.01),选取该浓度建立BV-2损伤模型作为AD细胞模型。
2分别将不同浓度的空白血清、LWDHS(2.5%、5%、10%、20%)作用于BV-2细胞,MTT法检测24小时的细胞活性,与空白血清各浓度组相比,LWDHS各浓度组的细胞活性均有所升高,其中10%、20%LWDHS组与10%、20%空白血清组相比有差异(P<0.05),细胞相对活性升高,LWDHS10%、20%组之间比较差异性不明显(P>0.05)。综合实验考虑选取10%浓度LWDHS作用于BV-2细胞模型,并将含有10%的LWDHS直接作用于BV-2细胞的组别设为LWDHS组。
3根据前期实验依次分组为空白对照组、Aβ25-35组、LWDHS+Aβ25-35组和LWDHS组,MTT法检测24小时的结果显示:与空白对照组相比,Aβ25-35组、LWDHS+Aβ25-35组细胞活性降低,差异有统计学意义(P<0.05);与Aβ25-35组相比,LWDHS+Aβ25-35组细胞活性有所升高(P<0.05)。
4ELISA实验结果显示:与空白对照组相比,Aβ25-35组IL-1β的分泌水平显著增高(P<0.01);与Aβ25-35组相比,LWDHS+Aβ25-35组的IL-1β分泌水平下降(P<0.05)。
5细胞免疫荧光结果显示:与空白对照组相比,Aβ25-35组BV-2细胞出现明显凋亡,细胞核固缩,细胞质荧光高表达;与Aβ25-35组相比,LWDHS+Aβ25-35组的细胞也出现凋亡,核固缩,甚至呈月牙状,细胞质荧光强度降低;LWDHS组与空白对照组比较,细胞核形态较完整,细胞质荧光强度减弱,无明显差异。
6qRT-PCR实验结果显示:与空白对照组相比,Aβ25-35组的TBP-2、S100A9、IL-1βmRNA水平提高(P<0.05或P0.01);与Aβ25-35组相比,LWDHS+Aβ25-35组的TBP-2、S100A9、IL-1βmRNA水平表达有下降趋势(P0.05)。
7Westernblot实验结果显示:与空白对照组相比,Aβ25-35组的TBP-2、NF-κBp65、IL-1β表达均上调(P<0.05);与Aβ25-35组相比,LWDHS+Aβ25-35组的TBP-2、NF-κBp65、IL-1β表达有所下调(P<0.05)。
结论
LWDHS对Aβ25-35损伤的BV-2细胞活性有一定保护作用,能够下调Aβ25-35刺激后炎症因子TBP-2、S100A9、NF-κBp65、IL-1β的表达水平,可能是通过调节TBP-2/S100A9炎症通路减少相关炎症因子的释放,从而降低细胞炎性损伤,保护神经元,起到防治阿尔茨海默病的作用。