突触传递由突触囊泡胞吐引发,该过程包括几个连续的步骤:停靠、准备和Ca2+激发的膜融合与递质释放。虽然突触泡的正确定向和胞吐的精细时空调节涉及多种蛋白质的相互作用,但一系列的实验证据提示该过程的关键调控是由两种具有相反作用的蛋白质介导的。一种是突触结合蛋白,它是一种Ca2+感受器,是Ca2+激发的膜融合和递质释放不可缺少的;另一种是Rab3蛋白,它能限制响应Ca2+刺激后能被融合的囊泡的数量。到目前为止,这两种蛋白质是如何发挥调节作用的还不完全清楚。Rab3A和突触结合蛋白1分别是大脑中丰度最高的Rab3蛋白和突触结合蛋白的异构体。在我们前期的体外实验中,Rab3A和突触结合蛋白1被首次证明可以直接相互作用,从而参与调节突触膜的融合和递质释放。在本研究中,我们利用洋地黄皂苷渗透化处理的PC12细胞作为模式细胞,以PC12细胞的主要儿茶酚胺递质多巴胺为检测指标,对Rab3A与突触结合蛋白1的相互作用及其对递质释放的影响进行了较为系统的探究。我们首先研究了 Rab3A对正常表达突触结合蛋白1的PC12细胞分泌多巴胺的影响。发现无论有无Ca2+存在细胞都分泌多巴胺,说明存在Ca2+-依赖和Ca2+-不依赖两种多巴胺分泌途径。不过,Ca2+-依赖的多巴胺分泌途径占优势,因为10 μMCa2+存在时的多巴胺释放量明显高于无Ca2+时的释放量(130.3 ng对34.5 ng,p<0.01)。而且还发现Rab3A对这两种多巴胺释放途径的影响是不同的。没有Ca2+存在时,低浓度的Rab3A(500 nM)减少多巴胺的释放而高浓度(1000 nM-2500 nM)则促进释放。但是,10μM Ca2+存在时,用不同浓度的Rab3A(500 nM-2500 nM)处理培养的PC12细胞则会随Rab3A浓度的升高而造成多巴胺释放量的持续降低。为了探究突触结合蛋白1与多巴胺释放的相关性及其与Rab3A蛋白在该过程中的相互作用,我们利用从5个候选序列中筛选出的特异性RNA干扰序列有效的抑制了 PC12细胞中突触结合蛋白1的表达,然后比较分析了 Rab3A在Ca2+存在和不存在的条件下对多巴胺释放的影响。发现无Ca2+存在的条件下,突触结合蛋白1表达抑制前后的多巴胺释放并无明显差别,提示突触结合蛋白1不介导Ca2+-不依赖性多巴胺释放。相反,RNA干扰基本抑制突触结合蛋白1的表达后,Ca2+-依赖性多巴胺释放与干扰抑制前相比减弱了(118.1 ng对130.3ng,p<0.01),从而证明突触结合蛋白1与Ca2+-依赖性多巴胺释放有关。在10 μM Ca2+存在的条件下,用不同浓度的Rab3A(500 nM-2500 nM)处理PC12细胞时导致多巴胺的释放量逐渐降低。但是,抑制释放的幅度与突触结合蛋白1表达抑制前相比明显降低了(2500 nM时降低18.4%),由此证明Rab3A对多巴胺释放的影响涉及与突触结合蛋白1的相互作用。与此同时,还发现在上述各实验条件下,PC12细胞内多巴胺的含量始终保持在一个相对稳定的水平,提示PC12细胞具有维持这种稳态的有效抑制。此外,为了验证实验结果的可靠性,我们利用Cellometer K1细胞功能分析仪对含洋地黄皂苷的Rab3A蛋白溶液处理过的PC12细胞进行了分析。结果表明,处理过的PC12细胞的凋亡率和细胞周期与对照细胞相比没有显著差异,证明用Rab3A处理后多巴胺释放的变化并非由于PC12细胞生理状态改变所致。除此之外,PC12细胞的透射电子显微观察提示,经Rab3A蛋白溶液处理后PC12细胞的分泌活动与对照细胞的相比明显减弱。