论文部分内容阅读
本研究以银耳Tr21为出发菌株,采用紫外线诱变方法处理对数生长期银耳芽孢,挑取12180个菌落,经过两轮筛选后得到5个对潮霉素敏感的菌株,在传代培养10代后,除一个菌株恢复对潮霉素抗性外,另外4个菌株保持突变性状,稳定遗传。通过冻融法将含有人胰岛素BCA基因及潮霉素磷酸转移酶hph基因的质粒pCB-BCA和pBHg-BCA分别单独转到根癌农杆菌EHA105和GV3101中。在质粒pCB-BCA中,目的基因及筛选标记基因前端所带启动子为花椰菜病毒35S启动子(P35S),pBHg-BCA所带启动子为双孢蘑菇gpd启动子。用以上携带不同质粒的农杆菌与银耳芽孢共培养后,在含有潮霉素的选择培养基上筛选转化子,只有携带质粒pBHg-BCA的农杆菌EHA105侵染银耳芽孢后得到抗性菌落,说明银耳可以识别双孢蘑菇gpd启动子,并且不同农杆菌介导转化存在宿主特异性。农杆菌介导转化,其转化效率受到多种因素影响。本试验通过设置农杆菌与银耳芽孢不同共培养时间、诱导剂乙酰丁香酮的浓度、银耳芽孢及农杆菌浓度等因素对转化效率影响,结果在乙酰丁香酮浓度为500μmol/mL、银耳芽孢浓度为108个/mL、农杆菌OD=0.5及共培养时间为2d时,转化效率最高,为310个转化子/108个银耳芽孢。随机挑选5个抗性菌落进行验证,PCR检测结果表明,人胰岛素基因已经整合到银耳基因组中;RT-PCR结果显示,在银耳细胞中可以检测到人胰岛素基因的mRNA;Southern杂交结果表明人胰岛素基因以单拷贝的形式整合到银耳基因组DNA中。转化子转接5代后对潮霉素仍有抗性,说明外源基因在银耳芽孢中能够稳定遗传。