研究背景特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一种原因不明的弥漫性肺间质疾病，主要表现为肺部炎症、肺泡持续性损伤及细胞外基质过度沉积。IPF的临床表现为活动性呼吸困难、常规X线胸片或HRCT显示双下肺和胸膜下分布为主的网状改变或伴蜂窝肺、限制性通气障碍、弥散功能降低和低氧血症。IPF确诊后平均生存期仅为3-5年，其确切的发病机制尚未完全阐明，缺乏有效特异的治疗手段来阻止或逆转肺纤维化。目前，IPF发病机制的研究仍为国内外研究的热点和难点。近年来，一些学者发现肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing factor,TRAIL）在急慢性气道炎症中起着非常重要的作用。本课题组的前期研究发现在鼻病毒诱导的气道炎症模型中，TRAIL调控MID1表达增加，MID1通过与PP2A催化亚基α4结合降低PP2A活性促进炎症因子在气道结构重塑中发挥作用，而TRAIL及其信号传递途径与肺纤维化形成的关系及机制尚未明了。目的通过体内、外实验首次明确TRAIL促进肺纤维化的形成，并阐述其调节下游信号传递途径的机制；探讨PP2A激活剂对肺纤维化形成过程的干预作用，为IPF的临床诊断及治疗提供了新的思路和方向。方法⑴对TRAIL基因敲除及其同源野生型小鼠进行一次性气管内灌注博莱霉素建立肺纤维化模型。应用Pulmonary Maneuvers PFT肺功能检测系统对小鼠进行肺功能检测，观察病理切片不同时期肺泡炎、肺纤维化程度的变化、计算机纤维化程度评分及qPCR法检测collagen α2(I)在mRNA水平上的表达判定肺纤维化程度，采用TUNEL染色检测细胞凋亡情况，ELISA法检测TRAIL在蛋白水平的表达，从而明确TRAIL对小鼠肺纤维化的促进作用。⑵建立小鼠肺纤维化模型，采用qPCR法检测MID-1及相关细胞因子TGF-β、MCP1、MMP9在mRNA水平上的表达情况，应用ELISA法检测PP2A磷酸化活性，从而明确TRAIL调节下游的信号传递途径的机制。⑶建立小鼠肺纤维化模型的基础上，同时外源性给予小鼠鼻内滴注AALs（PP2A激活剂）来干预博莱霉素所致的肺纤维化过程，分别使用了一次性AALs预处理（建模前1天给药）及持续性给AALs（建模当天给药并持续给药）两种干预方式，对小鼠进行肺功能检测，观察建模及给药后小鼠肺组织病理切片肺泡炎症情况、肺纤维化程度的变化、计算机纤维化程度评分及qPCR法检测collagenα2(I)在mRNA水平上的表达判定肺纤维化程度，并应用ELISA法检测PP2A磷酸化活性，评估PP2A激活剂对小鼠肺纤维化模型的影响。⑷从小鼠肺组织中分离原代肺成纤维细胞做体外原代细胞培养并传代，采用MTT法检测rTRAIL及AALs对其增殖的影响；实时荧光定量PCR检测成纤维细胞中MID-1、TGF-β及collagen α2(I)在mRNA水平上的表达情况。⑸收集IPF患者的临床资料、血清及肺活检组织，ELISA检测血清中TRAIL，肺组织中MID1、PP2A活性在蛋白水平上的表达情况。采用Pearson相关系数分析TRAIL及MID1与肺功能之间的相关性。结果⑴建模后第1天TUNEL染色显示肺组织中凋亡细胞明显增多（P<0.05）；建模后第4天TUNEL染色显示肺组织中凋亡细胞数量减少（P<0.05）；建模后第8天HE染色示肺组织中上皮细胞损伤、局部出血水肿明显，肺泡间隔和肺泡腔内大量炎细胞浸润，Masson染色可见少量胶原纤维被染成蓝色；建模后第21天Masson染色显示炎细胞浸润也较明显，纤维组织增生显著，局部呈条索瘢痕改变，部分肺泡结构消失。⑵根据计算机肺纤维化评分及collagen α2(I)mRNA表达情况，博莱霉素模型组（WT BLM）较正常对照组有明显的纤维化（P<0.01），小鼠最大顺应性、肺活量较正常对照组显著降低（P<0.01），而TRAIL敲除（TKO BLM）小鼠肺纤维化程度减轻，肺功能明显改善（P<0.05），与正常对照组没有显著性差异。⑶小鼠肺纤维化模型中，模型组较正常对照组肺组织中MID1及相关因子（TGF-β、MCP1、MMP9）在mRNA水平上表达增加（P<0.05）；敲除TRAIL基因的小鼠肺组织中上述因子在mRNA水平表达下降。相反，模型组较正常对照组肺组织中PP2A磷酸化活性降低（P<0.05）；敲除TRAIL基因的小鼠肺组织中PP2A磷酸化活性增高，差异具有统计学意义。⑷一次性药物干预组（WT BLMAALs（-1））与模型组纤维化程度一致，而持续药物干预组（WT BLM AALs）较模型组纤维化程度显著减轻（P<0.001），说明持续药物干预可改善小鼠肺功能，促炎因子TGF-β、MCP1、MMP9表达显著降低，说明AALs（PP2A激活剂）可减少炎症因子释放、干预纤维化形成。⑸低浓度rTRAIL可刺激成纤维细胞增殖，当其浓度为1ng/ml时，细胞增殖最为显著（P<0.001），collagen α2(I)表达也显著增加（P<0.01）；而在此基础上同时给予1uMAALs（PP2A激活剂）,collagen α2(I)表达反而下降（P<0.001）。⑹IPF患者血清中TRAIL表达显著升高（P<0.001），肺组织中MID1蛋白表达明显升高（P<0.05），PP2A活性显著降低（P<0.001）。IPF患者血清TRAIL表达水平与肺组织中MID1蛋白表达水平呈正相关(r2=0.8717,P=0.0007,n=8)，IPF患者血清中TRAIL表达水平与肺弥散功能（DLco）(r2=0.7528,P<0.0001,n=14)及残气容积（RV）(r2=0.7268,P=0.0001,n=14)呈负相关；IPF患者肺组织中MID1表达水平与DLco(r2=0.8903,P=0.0004,n=8)及RV(r2=0.7561,P=0.005,n=8)呈负相关。结论⑴TRAIL促进小鼠肺纤维化的形成，通过调节MID1表达增加，降低PP2A磷酸化活性，从而促进相关因子TGF-β、MCP1、MMP9的表达，最终导致肺纤维化形成。敲除小鼠TRAIL基因或持续给予小鼠PP2A激活剂，可缓解肺纤维化程度，干预肺纤维化形成，同时改善肺功能。该研究首次探讨了TRAIL能够促进肺纤维化的形成，不仅完善了肺纤维化的发病机制，同时也为我们临床治疗肺纤维化提供了新的治疗靶点。⑵低浓度的rTRAIL促进了小鼠肺原代成纤维细胞的增殖，而PP2A激活剂在一定程度上干预了肺原代成纤维细胞胶原蛋白的表达。⑶TRAIL及其信号传递途径参与IPF的形成，血清中TRAIL蛋白表达含量可作为IPF辅助诊断的一种新方法，也可以作为IPF病变程度的衡量标准之一。