背景和目的矽肺是由于长期吸入游离二氧化硅（SiO₂）粉尘而引起的以肺组织炎症和广泛纤维化为特征的一种职业病,发病机制尚不清楚。国内外以往研究发现,矽肺发生发展是多细胞参与、多因子调控的复杂过程,其中存在着细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫等多种免疫反应,但矽肺免疫的启动与控制、抗原性质及抗原递呈、获得性免疫应答触发与功能调控、免疫耐受与负相调控的方式与机制等关键环节尚不清楚或存在争议。既往观察矽肺免疫效应细胞主要见于巨噬细胞、淋巴细胞、肺上皮细胞、中性粒细胞等,而近年来被证实处于免疫启动、调控并维持免疫应答的中心环节的树突状细胞（dendritic cell,DC）是否参与矽肺的发生发展,尚未见系统化研究报道。DC与巨噬细胞有相近、交叉的结构与功能,其免疫反应枢纽性作用更为独特,且于呼吸系统各部位均有存在,故推测DC在矽肺免疫反应中可能也具有一定的作用。构建实验性矽肺大鼠模型,辅以体外实验模型,采用免疫组化、细胞共培养、流式细胞术、电子显微镜观察等技术,系统探索DC在二氧化硅粉尘识别与摄取、矽肺炎症与纤维化形成、调节矽肺免疫反应等方面的作用与机制,有助于深化对矽肺发生发展过程的认识,探讨潜在的矽肺生物标志和关键靶点,并为矽肺预防、早期发现和有效干预研究提供新的思路和理论依据。材料和方法1.树突状细胞与游离SiO₂粉尘相互作用与机制体外研究采用6⁸周龄SPF级雄性SD大鼠,从外周血分离单个核细胞,体外利用重组大鼠白介素-4（rr IL-4）、重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rr GM-CSF）和重组大鼠TNF-α（rr TNF-α）联合诱导,获得DC。支气管肺泡灌洗法提取SD大鼠肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages,AM）。流式细胞术和酶联免疫吸附测定法分别对诱导的DC进行CD80、CD86、MHC II表型分子和IL-12p70、IL18细胞因子检测。用流式细胞术和荧光倒置显微镜检测DC对荧光微球的吞噬功能;光镜和电镜下初步观察DC对SiO₂粉尘的吞噬作用及吞噬前后细胞形态与结构的变化。CCK8法分别检测不同浓度SiO₂粉尘在不同作用时间下DC和AM细胞活性的影响,确定后续染毒浓度。在建立DC和AM共培养模型（AM/DC）的基础上,设置对照组（DC组）、共培养组（AM/DC组）、直接暴露组（DC+SiO₂组）和间接暴露组（AM+SiO₂/DC组）,SiO₂粉尘暴露48 h后,扫描电镜下观察DC的形态变化;流式细胞术检测DC表型分子CD80、CD86、MHC II的表达和对荧光微球的吞噬情况;q RT-PCR和Western blot法检测暴露后DC中IL-12、IL-18、TLR4、TLR9、Myd88和NFκB等基因的m RNA和蛋白表达水平;尼龙毛柱法分离大鼠脾脏T细胞,暴露SiO₂粉尘后的DC和T细胞1:10混合培养24h,荧光倒置显微镜下观察DC和T细胞共培养后的细胞形态,流式细胞术检测Th1、Th2细胞分型。2.实验性大鼠矽肺发生发展过程中树突状细胞分布与作用的动态观察SD大鼠60只,随机分为模型组和对照组,每组各30只。采用非气管滴注染尘法建立大鼠矽肺模型,分别于染尘后1周、2周、3周、6周、12周处死（染尘组和对照组各6只）,取肺泡灌洗液、外周血和肺组织。倒置显微镜下观察不同时段矽肺大鼠肺组织的形态结构（HE染色）,对大鼠矽肺模型进行鉴定;投射电镜检测肺泡内DC对SiO₂粉尘的吞噬。流式细胞术检测肺泡灌洗液中DC、Th1、Th2细胞数量变化和外周血中DC的数量分布变化;Polymer双色免疫组织化学染色法检测肺组织中同部位DC（OX62⁺细胞）和AM（CD68⁺细胞）的数量与分布;ELISA法检测肺组织中Th1、Th2型细胞因子IL-4和IFN-γ的表达。另选10只SD大鼠,将活细胞荧光标记染料（Carboxyfluorescein succinimidyl amino ester,CFSE）标记的DC通过尾静脉注射进入大鼠体内,然后立即非气管滴注染尘法对大鼠进行SiO₂粉尘暴露,于染尘3周后处死,流式细胞术检测肺泡灌洗液中CFSE+DC占总DC的比例。3.统计学分析运用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计处理和分析,结果以c±s表示,两组间均数比较采用Student’s t检验,重复测量采用重复测量数据方差分析,多组间的比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD检验,检验水准α=0.05。结果1.原代培养DC的鉴定结果通过细胞因子联合诱导体外培养的大鼠外周血单核细胞12d后,显微镜下可观察到DC形成众多的细胞集落,细胞表面有大量的皱褶和突起,细胞内有丰富的细胞器和少量的空泡;DC的荧光微球吞噬率、DC细胞表型分子CD80、CD86、MHC II和分泌的细胞因子IL-12p70、IL-18均在第12天达到较高水平,差异有统计学意义（P<0.05）。2.SiO₂粉尘对体外培养DC和AM的细胞毒性结果SiO₂粉尘染毒后,DC和AM的细胞存活率均随着SiO₂粉尘浓度的增高而降低,相同染毒浓度下随着染毒时间延长而降低,差异有统计学意义（P<0.05）。SiO₂粉尘染毒12h后,80、100、120、140μg/ml剂量下DC的细胞存活率高于AM,差异具有统计学意义（P<0.05）;SiO₂粉尘染毒24h和48h后,20、40、60、80、100、120、140μg/ml剂量下DC的细胞存活率高于AM,差异均具有统计学意义（P<0.05）。3.SiO₂粉尘暴露对体外培养DC作用的观察结果电镜下观察到DC可以胞吞的形式吞噬SiO₂粉尘,吞噬SiO₂粉尘后细胞体积变大出现严重肿胀,表面的褶皱变浅或消失,细胞内出现大量的空泡,细胞器减少,所吞噬的SiO₂粉尘主要位于DC细胞空泡内。与对照组相比,直接暴露组DC对荧光微球的吞噬率下降,间接暴露组升高,差异均有统计学意义（P<0.001）。与对照组和共培养组相比,直接暴露组和间接暴露组DC表型分子CD80、CD86、MHC II的表达降低,差异均有统计学意义（P<0.05）。直接暴露组DC中IL-12、IL-18和TLR4、TLR9、Myd88、NFκB m RNA和蛋白的表达水平均高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）;间接暴露组DC中IL-12、IL-18和TLR4、TLR9、Myd88、NFκB m RNA和蛋白的表达水平均低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。直接暴露组DC中IL-12、IL-18和TLR4、TLR9、Myd88、NFκB m RNA和蛋白的表达水平高于间接暴露组,差异具有统计学意义（P<0.05）。SiO₂粉尘暴露后的DC与T细胞共培养后,CFSE荧光标记的T细胞会被直接暴露组和间接暴露组的DC吞入胞内,与对照组相比,T细胞存活数量减少;Th2细胞比例增高,Th1细胞比例下降,Th1/Th2比值降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.矽肺大鼠的肺组织形态观察结果光镜下可见染尘1、2周的大鼠肺泡腔有大量的炎性细胞聚集,肺间隔增宽;染尘3周时肺组织中出现众多的细胞性结节,结节周围有明显的炎性细胞浸润;染尘6周时有大量的细胞性结节和纤维性结节形成,结节间出现融合并形成大的结节;染尘12周时肺组织中可见大量纤维性结节,出现肺间隔断裂和肺泡融合。电镜下可见染尘3周时大鼠肺泡内的DC吞噬有SiO₂粉尘,吞噬后的SiO₂粉尘位于细胞空泡内,细胞质严重空泡化,细胞表面变得光滑,细胞器减少或消失,大部分空泡发生破裂融合。5.矽肺大鼠外周血DC数量、肺组织中DC、AM、Th1、Th2细胞数量和细胞因子变化的动态观察结果随着染尘时间延长,大鼠外周血CD80⁺DC、MHC II⁺DC比例逐渐增高,CD80⁺DC比例在2周时最高,MHC II⁺DC比例在3周时最高;与对照组相比,2、3、6、12周CD80⁺DC、MHC II⁺DC比例增高,差异均具有统计学意义（P<0.05）。随着染尘时间延长,大鼠肺泡灌洗液中OX62⁺DC的比例呈增高趋势,3周时达峰值。染尘2、3、6周时比例与对照组的差异均具有统计学意义（P<0.05）。随着染尘时间延长,大鼠肺组织的OX62表达呈先增高再降低,3周时表达最高。1、2、3、6周时表达均高于对照组,差异均具有统计学意义（P<0.05）;CD68表达呈先降低再增高,6周时表达最低;染尘1、2、12周时表达均高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。随着染尘时间延长,各时段染尘大鼠肺泡灌洗液中Th1细胞比例逐渐降低,Th2细胞比例逐渐增高,Th1/Th2比值逐渐降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比,1、2、3周时Th1细胞比例增高,1、2周时Th2细胞比例降低、12周时增高,1、2、3周染尘大鼠肺泡灌洗液中Th1/Th2比值增高,差异均具有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比,1周和2周染尘组大鼠肺组织中IFN-γ表达增高,差异有统计学意义（P<0.05）;1周染尘组大鼠肺组织中IL-4表达降低,12周染尘组大鼠肺组织中IL-4表达增高,与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.05）。6.SiO₂粉尘暴露对DC迁移功能影响的检测结果与对照组相比,3周染尘矽肺大鼠肺泡灌洗液中CFSE+DC阳性细胞占DC比例显著增高（P<0.01）。结论1.DC在体外培养和矽肺大鼠体内都具有直接吞噬SiO₂粉尘的作用,吞噬后的SiO₂粉尘位于细胞空泡内。DC可能比AM更耐受SiO₂粉尘的细胞毒性。2.SiO₂粉尘抑制DC的成熟,致其吞噬功能、细胞因子分泌功能和TLR4/TLR9/Myd88/NFκB信号转导通路蛋白表达水平的改变。3.矽肺发生发展过程中DC可从外周血向肺部迁移,炎症反应期肺内DC的增多和聚集最为明显,Th1/Th2细胞数量和其细胞因子水平也随之同步改变。DC可能通过改变Th1/Th2平衡调控机体免疫在实验性矽肺发生早期发挥作用。