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研究背景近二十年来,随着急诊经皮冠脉介入治疗的积极开展和规范化药物治疗的认真贯彻,急性心肌梗死的死亡率明显下降。然而,急性心肌梗死导致了不可逆的心肌细胞丢失和不良的心室重塑,部分患者后期发生了心力衰竭,从而严重影响了患者的长期预后。心肌梗死后促炎M1型巨噬细胞的过渡激活加剧了不良心室重塑和心功能不全的发生。在M1型巨噬细胞的三羧酸循环中存在两个断裂点,由天冬氨酸-精氨酸-琥珀酸旁路进行补偿,将中断的循环连续起来。氨氧基乙酸(Aminooxyacetic acid,AOAA)是该旁路中天冬氨酸氨基转移酶的强效抑制剂。先前的研究显示调控巨噬细胞代谢重编程可以控制巨噬细胞极化和炎症反应。因此,我们推测AOAA有可能通过调控巨噬细胞能量代谢来调节其极化,进而改善心肌梗死后心功能。研究目的(1)通过采用体外培养的小鼠原代骨髓源巨噬细胞(bone marrow derived macrophages,BMDMs)和RAW264.7细胞系,在细胞水平阐明AOAA对巨噬细胞能量代谢及极化的调控作用;(2)在此基础上,通过构建心肌梗死模型,进一步探讨AOAA对小鼠心肌梗死后心功能的影响及机制。研究方法和结果(1)提取小鼠骨髓细胞,在体外经M-CSF刺激培养7天,诱导其分化成BMDMs,通过形态学观察和流式细胞术明确BMDMs是否诱导成功;分别给予LPS 10 ng/mL+IFN-γ10ng/mL或IL-4 20ng/mL处理细胞24h,通过形态学观察、流式细胞术、免疫荧光、以及qPCR等方法明确M1型和M2型巨噬细胞是否极化成功。结果发现骨髓细胞经M-CSF诱导培养7天后变为纺锤形或不规则形,高表达CD11b和F4/80,提示这些细胞被成功诱导分化为BMDMs;经LPS+INF-γ或IL-4极化处理24h后,M1型巨噬细胞呈圆形或椭圆形,M2型巨噬细胞稍拉长,仍呈纺锤形或不规则形,前者高表达CD86、iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β,后者高表达CD206、Arg1、Ym1和IL-10,提示M1型和M2型巨噬细胞诱导成功;与此同时,我们也检测了 RAW264.7细胞系经上述极化诱导后的改变,结果发现形态变化不显著,但标志物及相关细胞因子的表达趋势与BMDMs基本一致,提示RAW264.7细胞系向M1型和M2型巨噬细胞极化成功。(2)在成功提取、诱导和极化巨噬细胞后,我们通过观察M0型、M1型和M2型巨噬细胞的培养上清颜色,测pH值、乳酸、ATP和糖酵解水平,qPCR检测糖代谢限速酶的表达,以明确巨噬细胞能量代谢的特点,并观察了 AOAA的调节作用。结果发现与M0型相比,M1型巨噬细胞培养上清转为淡黄色,pH值下降,乳酸水平增加,ATP产量下降,糖酵解水平升高,糖代谢限速酶表达增加;M2型巨噬细胞培养上清颜色和pH值无明显变化,但乳酸水平明显下降,ATP产量增加,糖酵解和糖代谢限速酶的表达受抑制。与此同时,我们检测了 RAW264.7细胞系极化后乳酸和ATP的水平,其变化趋势与BMDMs一致,进一步表明M1型和M2型巨噬细胞具有不一样的代谢特征。有趣的是,AOAA可增加M1型巨噬细胞pH值,抑制乳酸和糖酵解水平,呈剂量依赖性的增加ATP产量,还可抑制糖代谢限速酶的增加。提示AOAA促进了 M1型巨噬细胞的代谢向M2样转化。(3)由于调控巨噬细胞代谢重编程可以控制巨噬细胞的极化,在明确了 AOAA对巨噬细胞代谢的调节后,我们利用免疫荧光、Western blot及qPCR等技术在BMDMs和RAW264.7细胞系上评价了 AOAA对巨噬细胞极化的影响。我们发现AOAA可调节巨噬细胞的极化,主要是抑制巨噬细胞向M1型极化和促进其向M2型极化。这些数据表明AOAA可能是通过调控巨噬细胞代谢重编程来调节巨噬细胞极化。(4)随后,我们构建了小鼠心肌梗死模型,利用心超、Masson’s trichrome染色、HE染色、免疫荧光、Western blot及qPCR等技术评价了 AOAA对小鼠心功能、心梗面积、以及心脏局部炎症反应和巨噬细胞极化的影响。我们发现AOAA可缩小心梗面积,改善心功能,进一步研究发现AOAA抑制了心梗周边区M1型巨噬细胞的比例,增加了 M2型巨噬细胞的比例。相应的,我们发现AOAA调控了心脏中巨噬细胞相关促炎和抗炎细胞因子的表达。(5)NLRP3炎症小体在心肌梗死中具有重要的病理生理作用,且主要在巨噬细胞中激活。因而,我们利用Western blot及qPCR技术,从细胞和动物两个层面探讨了 AOAA对NLRP3-Caspase1/IL-1β信号通路的影响。结果发现AOAA可抑制M1型巨噬细胞和心肌梗死小鼠心脏组织中NLRP3、Caspase1和IL-1β的过度激活。研究结论(1)在免疫应答的炎症高峰期短期给予AOAA治疗可显著改善心肌梗死小鼠的心功能;(2)AOAA的心脏保护作用可能是通过调控巨噬细胞的能量代谢来调节巨噬细胞的极化实现的,至少部分是通过抑制NLRP3-Caspase1/IL-1β通路的过度激活实现的。本研究结果证实了通过调控巨噬细胞代谢重编程来改变巨噬细胞极化状态的可行性;强调了巨噬细胞在心肌梗死病理生理中的重要地位;同时为研发调控巨噬细胞极化和改善心肌梗死患者心功能的策略提供了一个新思路。