论文部分内容阅读
大肠杆菌以其遗传背景清楚、培养条件简单、生长快、成本低、易大规模培养等优势被广泛的用作基因工程中重组蛋白的表达系统。然而,大肠杆菌分泌大分子的能力有限,要从细胞内获得蛋白等大分子物质,需要用物理、化学、生物等方法使之破碎,再提取、纯化目的蛋白。在工业化应用中,这些传统方法或者无法实施,或者费用太高,而且会不同程度地破坏蛋白活性,另外,有些蛋白表达过量,易导致包涵体的形成。本文基于合成生物学的方法,以标准化生物砖为原材料,同时利用E7大肠杆菌素操纵子内的lysis基因,成功构建了表达1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的标准化诱导裂解回路,在L-阿拉伯糖的诱导下致死并裂解细胞,释放重组蛋白,并在胞外检测到酶活性,为大肠杆菌重组表达系统的研究提供了新的思路,开辟了新的方法。除此之外,为了提高破碎效果,延长破碎时间,更高效的获取重组蛋白,本文还结合了费氏弧菌体内的群体感应原理,构建了基于gfp基因和lysis基因的群体感应回路,初步建立了基于群体感应系统的细胞裂解新方法。本文所研究的主要内容和取得的主要结果有: 一、利用标准化生物砖元件启动子PBAD promoter,核糖体结合位点rbs1.0,终止子TT terminator,大肠杆菌素操纵子内lysis基因,以及实验室原有保存的PDOR表达回路,按照标准组装方法,成功构建L-阿拉伯糖诱导的细胞裂解回路pSB1A2-PBAD-rbs1.0-lysis-tt-T7-rbs1.0-dhat-tt。 二、考察了pSB1A2-PBAD-rbs1.0-lysis-tt-T7-rbs1.0-dhat-tt细胞裂解回路在不同诱导条件下的表达情况。首先用L-阿拉伯糖在转接后2h对回路进行单因素诱导,成功致死裂解细胞,宏观上体现为菌液较对照组更为澄清,且有泡沫产生,菌体OD600值较对照组显著下降,并能稳定在较低水平约1-2 h,证明了L-阿拉伯糖诱导裂解回路能按预想的实现裂解功能;然后考察L-阿拉伯糖在不同诱导时间下的破碎效果变化,发现随着诱导时间的推移,回路破碎效果逐渐减弱;最后考察了L-阿拉伯糖与IPTG双因素诱导下回路的表达情况,结果表明,仅受L-阿拉伯糖诱导的菌体破碎效果较双因素诱导的效果要好,而在对胞内外蛋白成分、蛋白酶活的分析与测定时,本文通过SDS-PAGE以及质谱分析方法成功在胞外上清液中检测到PDOR的存在,并在后续酶活测定中检测到其蛋白活性,证明该回路可以按照预期工作,不仅能够致死细胞,还能成功释放有活性的重组蛋白。 三、利用标准化生物砖元件luxI、luxR、lux pR promoter,构建了基于gfp报告基因的不同RBS群体感应回路,通过测量单位OD600菌体荧光强度来考察不同RBS对于luxpR下游基因表达情况的影响。结果显示,在L-阿拉伯糖的诱导下,随着时间的推移,单位OD600菌体荧光强度逐渐上升,并在7-8 h时达到稳定,而无论是荧光表达速率还是菌体终荧光强度,rbs1.0的回路都比rbs0.01的回路要高,因此可以得出结论,luxI基因前rbs强度的高低对于lux pR下游基因表达有着重要的影响。 四、利用POE-PCR方法,将gfp报告基因替换成lysis裂解基因,构建了rbs0.6的群体感应裂解回路,并对其进行表征。结果显示,在转接后3h加入L-阿拉伯糖诱导,比5h时加入菌体OD600下降得更多,但两者均能稳定在较低水平长达4-5 h,证明群体感应系统确实可以提高破碎效果、延长Lysis蛋白作用时间,而对诱导时间的优化还为重组蛋白在胞内的积累以及后续工业中规模化获取胞内蛋白奠定了基础。