ZHX2(zinc fingers and homoboxes 2),即锌指结构与同源结构域蛋白2,是一个转录抑制因子,与ZHX1、ZHX3组成锌指结构及同源结构域家族蛋白。研究发现,ZHX2在肝癌、肺癌、霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤疾病中表达下调,因此ZHX2被鉴定为一个新的抑癌基因。此外,ZHX2尚可转录抑制肝癌细胞中重要的肿瘤标记物甲胎蛋白(AFP)、GPC3的表达,并通过调控细胞周期蛋白,抑制细胞的过度增殖,进一步说明ZHX2在抑制肿瘤发生和进程中起着重要作用,并为肝癌的诊断和预后监测提供了新的候选分子。与其他遗传背景相似的小鼠相比,Balb/cJ小鼠肝脏内的ZHX2表达水平显著降低,并可以避免高脂饮食饲喂诱导的高脂血症。通过数量性状位点图谱鉴定发现,脂质代谢相关基因LPL的表达水平与ZHX2表达水平呈现相反的表达趋势,这也许是因为饲喂高脂饮食后,Balb/cJ小鼠肝脏中高表达的LPL能摄取更多血浆甘油三酯,使血浆中甘油三酯的水平低于其他品系的小鼠。LPL全称脂蛋白脂肪酶,是机体分解甘油三酯的关键酶。LPL通过肝素结合位点以同源二聚体的形式锚定在血管内皮细胞表面,负责摄取载脂蛋白中的甘油三酯,供给需要能量的组织,如骨骼肌、心肌等；或将甘油三酯贮存在脂肪组织中。同ZHX2调控的另一个靶基因AFP类似,LPL也是一个在胚肝中高表达,在成人肝脏中低表达的基因。以上研究提示,ZHX2与LPL之间可能存在表达调控关系。我们实验室的前期工作表明,ZHX2可以结合到LPL启动子上,从转录水平抑制LPL的表达。ZHX2是一个多结构域的蛋白,全长837个氨基酸,分为两个锌指结构域和五个同源结构域,同源结构域1和同源结构域2之间有一个脯氨酸富含区。为进一步明确ZXH2转录抑制LPL表达的关键功能域,我们构建了不同长度ZHX2截短体的表达质粒,并研究其对LPL表达的抑制作用。研究目的1.构建包含不同功能域的ZHX2表达质粒,检测对LPL表达的影响,筛选出能抑制LPL表达的ZHX2蛋白功能域。2.检测全长或截短型ZHX2蛋白对LPL核心启动子活性的影响,进一步验证ZHX2关键功能域的转录抑制活性。研究方法1.截短型ZHX2表达载体的构建根据已有文献报道,ZHX2同源结构域4,5没有明确的抑制功能。本实验室之前已构建ZHX2锌指结构域1至同源结构域2(1-501aa)、同源结构域1至同源结构域2(242-501aa)、同源结构域1(242-338aa)三种截短体质粒。在此基础上,本课题进一步构建了ZHX2同源结构域1至部分脯氨酸富含区242-439aa(不含入核序列)及242-446aa(含入核序列)的截短体质粒,酶切和测序验证载体是否构建成功。2.抑制LPL-表达的ZHX2功能域的筛选在肝癌细胞系SMMC7721及HepG2中,转染ZHX2全长及各个截短体质粒。48小时后收RNA。RT-PCR检测LPL mRNA水平的变化。3.验证ZHX2对LPL核心启动子的调控作用将LPL核心启动子报告质粒分别与ZHX2全长及上述筛选出的、抑制LPL表达的ZHX2功能域过表达质粒共转入HEK293细胞中,以pRL-TK质粒为内参。48小时后收蛋白,双荧光检测ZHX2对LPL核心启动子的影响。研究结果1.截短型ZHX2表达质粒的构建和验证以pcDNA3质粒为骨架,在多克隆位点处的酶切位点EcoR I与Kpn Ⅰ之间插入编码不同长度ZHX2截短体ZHX2(242-439aa). ZHX2(242-446aa)的序列,T4连接酶连接粘性末端处的缺口,双酶切实验初步验证载体构建成功,最后测序确保构建载体的正确性。2. ZHX2(242-446aa)是转录抑制LPL表达的较小功能域在肝癌细胞系SMMC7721及HepG2中过表达ZHX2全长及包含不同功能域的截短体质粒,RT-PCR结果表明,与pcDNA3对照组相比,除了ZHX2全长的质粒具有抑制LPL表达的功能外,含锌指结构域1至同源结构域2(1-501aa)、同源结构域1至同源结构域2(242-501aa)、同源结构域1及部分脯氨酸富含区(242-446aa,含入核序列)区域仍有抑制功能;但同源结构域1至部分脯氨酸富含区(242-439aa,不含入核序列)及同源结构域1(242-338aa)的截短体质粒抑制功能消失。因此,ZHX2(242-446aa)是转录抑制表达的较小功能区。3. ZHX2(242-446aa)可抑制LPL核心启动子的活性将ZHX2全长或242-446aa片段的表达质粒与LPL核心启动子(-197～+96)共同转染入HEK293细胞中,双荧光素酶实验检测启动子活性。结果显示,与对照组相比,ZHX2(242-446aa)区域及ZHX2全长对于LPL的核心启动子均有抑制作用,进一步证实了ZHX2(242-446aa)对LPL表达的转录抑制作用。研究结论与意义：1.ZHX2可以从转录水平抑制LPL启动子的表达,ZHX2(242-446aa)是抑制LPL表达的较小功能域。2.LPL是体内分解甘油三酯的限速酶,与动脉粥样硬化、糖尿病等多种代谢相关疾病关系密切。研究ZHX2对LPL的转录水平调控,为了解脂质代谢相关疾病的发病机制,临床治疗肥胖、动脉粥样硬化等疾病提供新的思路。ZHX2是一个表达谱较为广泛的转录抑制因子,文献中northern blot结果显示,ZHX2 mRNA存在于全身大部分组织器官,包括免疫系统。在外周血淋巴细胞及肝脏、脾脏、胸腺等免疫器官和各种免疫细胞中均可检测到ZHX2表达。已有研究显示,ZHX2参与了细胞周期进程等众多生物学过程。另有文献报道,ZHX2作为一种转录抑制因子,在组织器官发育中亦发挥重要作用。在脑皮层发育中,神经祖细胞可表达ZHX2蛋白,并通过与Ephrin B1相互作用,维持神经祖细胞的干性。在红细胞分化过程中ZHX2表达下调,而在B细胞发育过程中ZHX2的表达逐渐升高,参与转录调控其他基因。在肾脏中,ZHX家族蛋白参与调控正常足细胞基因表达,而ZHX2、ZHX1作为转录因子参与调控原发性肾小球疾病中的基因表达的改变。然而,ZHX2在免疫细胞功能调节及炎症反应中的作用目前还没有报道。肝脏是人体最大的实质器官,毗邻脾脏和小肠,从门静脉和肝动脉进入肝脏的血液中含有多种抗原成分。除肝细胞外,肝脏包含大量非实质细胞,其中大部分都是免疫细胞,如T细胞、NK细胞、DC细胞及枯否细胞。因为具有如此复杂的免疫微环境,所以肝脏被认为是最大的免疫器官。枯否细胞是在肝脏中居留的巨噬细胞。占全身巨噬细胞系统的80%-90%。巨噬细胞可以分泌大量的促炎细胞因子,参与炎症反应,产生趋化因子招募其他免疫细胞,还作为APC表达辅助刺激分子激活效应免疫细胞,是肝脏免疫防御的重要组成部分。由枯否细胞和静脉窦内皮细胞组成的网状内皮细胞系统可以分泌急性期蛋白、补体蛋白,是机体免疫系统抵御外来入侵的重要防线。病毒感染,自身免疫性疾病,酒精或某些药物可以引起急慢性肝炎,持续性炎症会造成肝硬化和肝癌。ConA和LPS/GalN诱导的小鼠急性肝炎模型较好地模拟了人类炎症性肝病的发生发展过程。本课题以ConA诱导的急性肝炎为主,研究ZHX2在急性肝炎中的作用。研究目的1.利用肝炎动物模型,检测ZHX2在肝组织中的表达变化,初步研究其在急性肝炎发病中的作用。2.ZHX2在巨噬细胞中的表达及其对巨噬细胞活化的调控作用。研究方法1.急性肝炎小鼠肝组织中的ZHX2表达变化1.1 ConA肝炎模型的建立6-8周的雄性C57BL/6小鼠,分为两组,每组4只,实验组尾静脉注射ConA(20mg/kg),对照组尾静脉注射PBS。8h后,处死小鼠,留取血清,检测ALT水平。留取肝组织,提取RNA, RT-PCR检测ZHX2表达的变化。1.2 LPS/GaIN肝炎模型的建立6-8周的雄性C57BL/6小鼠腹腔注射LPS/GalN (LPS 50 ug/kg, D-GalN 800mg/kg),诱导小鼠产生急性肝炎。对照组小鼠腹腔注射等量PBSo 5h后,留取血清,检测血清ALT水平。取肝组织,RT-PCR检测实验组与对照组小鼠ZHX2表达水平的变化。2.ZHX2过表达对ConA诱导小鼠急性肝炎的影响为了避免尾静脉高压注射对小鼠肝脏造成的损伤,课题组利用体内转染试剂PEI携载质粒的方法在小鼠体内过表达ZHX2。6-8周雄性C57BL/6小鼠,实验组尾静脉注射PEI与pcZHX2-HA质粒混合物(350ul/只),对照组注射pcDNA3质粒。转染后48h,尾静脉注射ConA (10mg/kg)诱导小鼠产生急性肝炎。6h后摘眼球取血处死小鼠,取血清测ALT水平。取部分肝组织以4%多聚甲醛固定,制备石蜡切片,用于HE染色进一步观察肝组织坏死及炎性细胞浸润情况以及TUNEL染色观察肝细胞凋亡情况。另取部分肝组织用于提取组织蛋白和RNA,Western blot检测肝组织中ZHX2过表达水平,检测凋亡相关分子的表达。剩余肝组织用于提取肝单个核细胞。RT-PCR检测肝单个核细胞中ZHX2和炎性细胞因子的表达情况。3.ZHX2-在巨噬细胞中的表达及其对巨噬细胞活化的调控作用3.1ConA及LPS刺激对巨噬细胞中ZHX2表达的影响以不同剂量的ConA或LPS分别刺激淀粉诱导的腹腔巨噬细胞,或以同一剂量刺激不同时间点。收细胞,提取总RNA。RT-PCR检测ZHX2及促炎细胞因子的表达变化。3.2巨噬细胞中的ZHX2对炎性细胞因子表达的影响为了进一步明确ZHX2在巨噬细胞活化中调控作用,我们以淀粉诱导的腹腔巨噬细胞或骨髓来源的巨噬细胞为研究对象。转染ZHX2特异性小干扰,以NCsiRNA为阴性对照,转染48h后分别用不同剂量的LPS刺激后,6小时后收细胞,提取总RNA,以RT-PCR检测干扰ZHX2后促炎细胞因子的表达变化。研究结果1.ZHX2在急性肝炎中表达上调1.1 ConA诱导肝炎的肝组织中ZHX2表达上调用ConA诱导C57BL/6小鼠产生急性肝炎,8h后处死小鼠,血清ALT水平检测结果显示,与PBS对照组相比,ConA诱导后的小鼠血清ALT水平明显升高,说明肝炎模型诱导成功。RT-PCR检测肝组织中ZHX2的表达,结果显示,与PBS对照组小鼠相比,ConA模型组小鼠肝组织中ZHX2表达水平同样明显升高。1.2 LPS/GalN肝炎模型肝组织中的ZHX2表达上调用LPS/GalN诱导C57BL/6小鼠产生急性肝炎,5h后处死小鼠,血清ALT水平检测结果显示,LPS/GalN诱导肝炎小鼠血清ALT水平明显高于PBS对照组。RT-PCR结果显示,LPS/GalN诱导肝炎小鼠肝组织中ZHX2表达水平显著高于PBS对照组小鼠。2.ZHX2过表达加重ConA诱导的小鼠肝损伤利用PEI携载ZHX2质粒,通过尾静脉注射在C57BL/6小鼠肝脏中过表达ZHX2。48h后用低剂量的ConA (10mg/kg)诱导小鼠产生急性肝炎,6h后处死小鼠,检测小鼠血清ALT水平。结果表明,过表达ZHX2组小鼠ALT水平高于pcDNA3组,提示过表达ZHX2后,小鼠肝组织损伤加重。组织切片HE染色结果显示,与pcDNA3注射组小鼠相比,ZHX2过表达组的小鼠肝组织中存在大量肝细胞变性坏死、组织充血,炎性细胞的浸润也更为严重。TUNEL染色结果显示,ZHX2过表达组小鼠肝组织中TUNEL染色阳性的凋亡细胞数目明显多于pcDNA3组。肝单个核细胞及肝组织RT-PCR检测结果显示,过表达ZHX2组小鼠促炎细胞因子IL-1β的表达显著高于pcDNA3对照组,差异具有统计学意义而IFN-γ、TNF-α和iNOS的表达水平亦具有升高的趋势。以上结果提示,ZHX2过表达可加重ConA诱导的肝损伤并促进炎性细胞因子的分泌。3.ZHX2在巨噬细胞中表达及其对巨噬细胞活化的调控作用3.1 LPS及ConA剌激上调腹腔巨噬细胞中ZHX2的表达以不同剂量ConA刺激腹腔巨噬细胞,或以同一剂量ConA刺激不同的时间点,检测巨噬细胞中ZHX2表达变化。RT-PCR结果显示,ConA可诱导巨噬细胞中ZHX2的表达,而炎性因子IL-1β、IL-6的表达没有变化。以不同剂量LPS刺激腹腔巨噬细胞,或同一剂量LPS刺激不同的时间点,RT-PCR检测细胞中ZHX2表达变化,结果显示ZHX2表达明显上调,同时伴随炎性因子IL-1β、IL-6表达的上调。3.2 ZHX2小干扰可抑制巨噬细胞炎性因子的分泌利用ZHX2 siRNA敲低小鼠腹腔来源巨噬细胞或骨髓来源巨噬细胞中ZHX2的表达,然后以不同剂量的LPS刺激,RT-PCR检测ZHX2及炎性细胞因子的表达。结果显示,siRNA封闭ZHX2的表达后,炎性细胞因子TNF-α,IL-6及iNOS与对照组相比表达水平有下调的趋势。以上结果初步提示,ZHX2可调节巨噬细胞活化后炎性细胞因子的分泌。研究结论及研究意义1.ZHX2在炎症性疾病中的作用尚未见报道,本研究首次证实ZHX2过表达可加重ConA诱导的肝损伤,为ZHX2功能研究提供新的依据。2.首次发现炎性刺激可调节巨噬细胞中的ZHX2表达,且干扰ZHX2可影响巨噬细胞炎性细胞因子的分泌,为阐明巨噬细胞活化及其参与疾病的发生机制提供新的思路。