【摘 要】
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目的:构建带有HA标签的人MDM2截短体N端和C端重组真核表达载体HA-MDM2-N/HA-MDM2-C,并检测截短体与NLK的相互作用。方法:(1)根据NCBI提供的人MDM2基因CDS序列(CCDS8986.2)设
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目的:构建带有HA标签的人MDM2截短体N端和C端重组真核表达载体HA-MDM2-N/HA-MDM2-C,并检测截短体与NLK的相互作用。方法:(1)根据NCBI提供的人MDM2基因CDS序列(CCDS8986.2)设计扩增N端(7-301AA)与C端(294-497AA)截短体所需引物序列,在引物的5’端加上相应的酶切位点。以MYC-MDM2质粒为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。用Bam HⅠ/XhoⅠ处理目的片段和p HAGE-3 x HA-linker-C载体并纯化回收。载体与目的片段连接并转化到T1感受态细胞中,通过菌落PCR鉴定阳性克隆并测序。(2)将测序结果正确的重组真核表达载体HA-MDM2-N和HA-MDM2-C各2μg转染至HEK293T细胞中,48h后收集细胞,SDS裂解液裂解细胞提取蛋白,Western blot检测HA标签蛋白的表达。(3)HA-MDM2-N和HA-MDM2-C质粒分别与MYC-NLK质粒共转染至HEK293T细胞中,48h后收集细胞,NP40裂解液提取蛋白,免疫共沉淀实验检测MDM2的N端/C端截短体与NLK的相互作用。结果:(1)菌落PCR与DNA序列测序结果表明HA-MDM2-N和HA-MDM2-C截短体构建成功。(2)Western blot结果显示HA-MDM2-N和HA-MDM2-C截短体可以在HEK293T细胞中特异性表达。(3)免疫共沉淀实验结果表明HA-MDM2-N和HA-MDM2-C截短体与NLK都可以结合,HA-MDM2-C与NLK结合较强,HA-MDM2-N与NLK结合较弱。结论:MDM2的N端/C端两个结构域同时参与了与NLK的相互作用。推测NLK主要是结合MDM2的C端结构域,抑制MDM2的E3连接酶活性进而达到稳定P53的作用;同时也可以结合MDM2的N端结构域,减弱MDM2与P53的结合。
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