论文部分内容阅读
子宫内膜癌是威胁女性健康的生殖系统高发肿瘤,目前其发病率较高且发病年龄逐渐年轻化。然而,子宫内膜癌的确切病因及发病机制尚未明确。子宫内膜癌的发生发展是多因素多步骤作用的复杂过程。流行病学调查研究显示,肥胖、糖尿病、高血压是子宫内膜癌发病极为重要的危险因素,又被称为子宫内膜癌的“三联征”。1998年WHO将以肥胖、高血压、高血糖、高血脂等为主要表现的临床症候群正式定义为代谢综合征（metabolic syndrome,MS）,其中心环节是胰岛素抵抗及继发的高胰岛素血症。MS与子宫内膜癌的发生紧密相关,因此以高胰岛素血症为切入点研究子宫内膜癌可为其早期防治提供新的方向。胰岛素一方面可广泛调节机体的物质代谢,另一方面作为生长因子,可通过主要的信号通路PI3K/Akt、MEK/ERK调控细胞增殖、分化、迁移等。研究发现,高水平胰岛素使PI3K/Akt信号通路过度活化,促进子宫内膜癌细胞增殖并抑制其凋亡,在子宫内膜癌的发生发展中发挥一定作用。PI3K/Akt信号通路是细胞内常见的促进细胞生长、迁移,抑制细胞凋亡、促进肿瘤血管生成等的活性信号通路。此信号通路的异常激活参与多种恶性肿瘤如乳腺癌、肝癌等的发生发展。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1（the insulin-like growth factor binding protein-related protein 1,IGFBP-rP1）,是胰岛素样生长因子结合蛋白（the insulin-like growth factor binding proteins,IGFBPs）家族中的一员。IGFBP-rP1的生物学功能有两个方面,一方面与传统的IGFBPs一样,可运输并调节胰岛素样生长因子（the insulin-like growth factor,IGF）的半衰期,间接调控IGF的生物学活性。相较于传统的IGFBP1-6,IGFBP-rP1与IGF的结合力较低,但可与胰岛素高度结合,结合后可减弱机体的胰岛素敏感性引起糖代谢紊乱。另一方面,IGFBP-rP1可不依赖于IGF独立调控细胞的增殖凋亡、血管生成等,在多种肿瘤如肝癌、卵巢癌、乳腺癌等中发挥抑制因子的作用。课题组前期研究发现,在子宫内膜癌细胞中运用转染技术上调IGFBP-rP1表达后,细胞的增殖受到抑制且凋亡增加。IGFBP-rP1极有可能介导了子宫内膜癌的抑制作用,但其具体作用机制尚不清楚。现代预防医学模式提示,子宫内膜癌的防治应从阻断子宫内膜的癌变过程提前到对其高危因素的预防。高胰岛素血症时可激活子宫内膜癌细胞中信号通路进而参与子宫内膜癌的发生发展,因此探讨IGFBP-rP1在胰岛素活化PI3K/Akt信号通路中的作用,可为子宫内膜癌的早期防治开拓新的思路。目的检测IGFBP-rP1在子宫内膜癌细胞系中的表达情况,在低表达IGFBP-rP1细胞系中加入IGFBP-rP1并经胰岛素刺激后,探讨IGFBP-rP1在胰岛素活化PI3K/Akt信号通路中的作用,为子宫内膜癌的早期防治提供可能方案。材料和方法1研究对象选取四种常见的子宫内膜癌Ishikawa、RL95-2、HEC-1A、HEC-1B细胞系,在37℃,含5%CO2的细胞培养箱中,置于相应的培养基中进行培养。2实验方法检测Ishikawa、RL95-2、HEC-1A、HEC-1B细胞中IGFBP-rP1的表达情况。筛选出IGFBP-rP1相对低表达的子宫内膜癌细胞系作为后续实验对象。细胞免疫荧光法检测IGFBP-rP1的定位,RT-PCR、Western blot法检测IGFBP-rP1mRNA与蛋白的表达。筛选PI3K/Akt信号通路活化程度最高时,胰岛素的作用时间。10-6M胰岛素作用HEC-1A细胞0、15、30、60、120、240min后,应用Western blot法检测p-Akt、Akt蛋白的表达情况。IGFBP-rP1在胰岛素活化PI3K/Akt信号通路中的作用。分为空白对照组、不同浓度IGFBP-rP1组（0、50、500、1000ng/ml）,其中空白对照组未做任何处理,不同浓度IGFBP-rP1组在加入相应浓度IGFBP-rP1作用24h后,再用胰岛素刺激30min,Western blot法检测p-Akt、Akt蛋白的表达情况。3统计学方法采用SPSS20.0软件进行实验数据的处理与统计学分析,实验结果以?x±s表示。实验结果的统计以多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。以α=0.05为检验水准。结果1四种子宫内膜癌细胞系中IGFBP-rP1的表达情况细胞免疫荧光染色结果表明,四种子宫内膜癌细胞系中IGFBP-rP1蛋白主要表达于细胞质。实时荧光定量PCR结果示,HEC-1A细胞中IGFBP-rP1mRNA表达量低于其他三种细胞系,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果示,Ishikawa、RL95-2、HEC-1A、HEC-1B细胞中IGFBP-rP1蛋白的相对表达量分别为0.586±0.065、0.367±0.042、0.047±0.025、0.132±0.028。HEC-1A细胞中IGFBP-r P1蛋白的相对表达量最低,与其它三种细胞系比较差异有统计学意义（P<0.05）。2胰岛素对HEC-1A细胞PI3K/Akt信号通路的活化作用10-6M胰岛素作用于HEC-1A细胞不同时间,Akt蛋白的活化水平在15min时即明显升高（P<0.05）;在胰岛素作用30 min时,Akt蛋白的活化水平达到峰值,与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。故选取30min进行后续实验。3 HEC-1A细胞中,外源性IGFBP-rP1在胰岛素活化PI3K/Akt信号通路中的作用不同浓度IGFBP-rP1作用时,与0ng/ml IGFBP-rP1组比较,50ng/ml IGFBP-rP1组p-Akt/Akt比值为0.906±0.030,差异无统计学意义（P>0.05）,500ng/ml IGFBP-rP1组、1000ng/ml IGFBP-rP1组p-Akt/Akt比值分别为0.677±0.052、0.404±0.071,Akt蛋白的活化水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论IGFBP-rP1可抑制胰岛素对子宫内膜癌细胞PI3K/Akt信号通路的活化,提示其可能在子宫内膜癌发生发展中发挥一定作用。