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家蚕是重要的经济昆虫之一,也是非常重要的模式昆虫和实验材料,蚕蛹是重要的蚕桑产业副产物,对蚕蛹脂肪酸组成及其合成机制的研究可以为蚕蛹的综合利用提供理论依据,对家蚕脂肪酸合成代谢的分子机制研究显得十分必要。本论文基于家蚕最新基因组数据库资源,通过生物信息分析方法对家蚕脂肪脱氢酶进行克隆、序列分析,并对家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因进行了表达模式、原核表达、酿酒酵母表达等研究,为探究BmFAD3-like和BmD6DES基因的功能,对低温诱导、真菌侵染和RNAi的处理后的蚕蛹体内两个基因的mRNA相对转录水平变化进行了初步研究。获得如下研究结果:1.家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的克隆及序列分析利用脂肪酸脱氢酶蛋白保守的组氨酸结构域序列对家蚕基因组序列进行同源性检索,设计合成特异性引物,从蚕蛹中分别克隆到1 083 bp和1 335 bp的cDNA片段,分别命名为BmFAD3-like和BmD6DES。利用cDNA末端快速快速扩增技术（RACE）对两个脂肪酸脱氢酶基因进行了cDNA全长扩增,BmFAD3-like全长为1 727 bp,开放阅读框（ORF）全长1 083 bp,编码360个氨基酸,预测分子量为41.5 KDa,等电点为7.1;BmD6DES全长为2 298 bp,开放阅读框（ORF）全长1 335 bp,编码444个氨基酸,预测分子量为51.7 KDa,等电点8.05。两条基因的编码蛋白均不含信号肽序列。基于家蚕及其它昆虫脂肪酸脱氢酶蛋白保守序列的多序列比对结果,构建了脂肪酸脱氢酶基因系统进化树,BmFAD3-like和BmD6DES基因同昆虫中已报道的其它脂肪酸脱氢酶基因之间的相似性较小。2.家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的表达模式研究利用semi RT-PCR方法检测家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因在家蚕个体发育过程中的表达模式研究。BmFAD3-like和BmD6DES两个基因在家蚕大部分个体发育期都有表达,只是表达量有差异。其中BmFAD3-like基因,从蚁蚕期到三龄眠期都有显著表达,从4龄起蚕到成蛾产卵期持续显著高表达,但是在卵期的表达极弱几乎检测不到。BmD6DES基因在家蚕不同发育时期的表达模式和BmFAD3-like基因非常相似,不同的是其在于蛹期特别是在蛹变态发育期的表达量明显高于其他时期,并且在蛾后期表达有明显的下降。通过分析家蚕幼虫5龄3d各组织中BmFAD3-like和BmD6DES两个基因的表达模式,BmFAD3-like基因在幼虫5龄第3天的各个组织器官中均有表达,特别是在卵巢、脂肪体、血淋巴、表皮和表达相对较高,在中肠、丝腺、精囊中表达量极少。同样,BmD6DES基因在家蚕幼虫5龄第3天各组织中也均有表达,特别是在脂肪体、表皮、精囊和卵巢表达相对较高,在中肠、丝腺、头部和血淋巴中表达量极少。总之,家蚕脂肪酸脱氢酶基因主要在家蚕成虫-蛹-蛾变态发育的后期和脂肪体、表皮和生殖器官中表达,推测其可能与家蚕脂质体的存储、生殖发育、求偶交配、信息素合成有关。3.家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因原核表达研究将BmFAD3-like和BmD6DES基因构建重组载体后转入大肠杆菌表BL21（DE3）中,体外表达两个基因的编码蛋白并用含His-tag的层析柱纯化所表达蛋白,原核表达的结果显示,BmFAD3-like和BmD6DES基因所编码的蛋白使用最终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导4 h后,融合蛋白能够被大肠杆菌高效表达;所表达的两种融合蛋白为非可溶性蛋白,在大肠杆菌内以包涵体形式存在;Western Blotting印迹结果验证了重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中获得成功表达,电泳结果显示所表达蛋白质分子量为44.3KDa和54.8 KDa,其大小与预测的BmFAD3-like和BmD6DES基因编码蛋白质相一致。4.家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因在酿酒酵母细胞表达研究将BmFAD3-like和BmD6DES基因双酶切后构建到酿酒酵母表达载体pYES2.0中,将工程菌株进行发酵,发酵液中添加2%的半乳糖糖诱导目的基因表达,亚油酸LA做为外源底物。气相色谱分析工程菌发酵产物的脂肪酸成分,以只含pYES2.0空质粒的工程菌为对照。结果表明这两个基因都能在酵母中表达,与对照相比pYBmFAD3-like发酵产物中产生了一种新的脂肪酸色谱峰,经鉴定为α-亚麻酸（ALA）即C18:3?9,12,15,含量占发酵产物总脂肪酸的2.8%,同样pYBmD6DES发酵产物中也产生了一种新的脂肪酸色谱峰,经鉴定为γ-亚麻酸（GLA）即C18:3?6,9,12,含量占总脂肪酸的2.1%。5.家蚕BmFAD3-like和BmD6DES基因的表达调控研究为进一步探究BmFAD3-like和BmD6DES基因的表达调控,我们对这两个基因在蚕蛹受低温诱导、真菌侵染和siRNA介导的RNAi处置后的相对转录水平进行了qRT-PCR检测。蚕蛹BmFAD3-like和BmD6DES基因受低温诱导后mRNA表达量在0℃下36 h后有30%和28%的上调,但此后mRNA的相对转录水平和对照相比并无较大变化,推测低温能诱导mRNA的上调表达,但是不能大幅度提升蛋白质（酶）的活性。BmFAD3-like和BmD6DES基因在真菌侵染的诱导下mRNA相对转录水平在6 h后有分别有160%和145%的上调,12 h后mRNA的相对转录水平超过对照量120%和110%,到60 h后蛹体内BmFAD3-like基因表达量不到对照的20%。蚕蛹BmD6DES在siRNA介导的RNAi干涉后mRNA表达量在25℃下12 h后分别有8%和10%的下调,此后随着时间的增加mRNA的相对转录水平一直下降,到36 h后下降达到最大值的45%和60%,蚕蛹BmFAD3-like和BmD6DES基因的mRNA相对转录水平能有效地被siRNA介导的RNAi干涉。