自然界中的突发传染病从未停止出现,很大一部分是与动物相关的,如非典型性肺炎、中东呼吸道综合征、禽流感、埃博拉出血热等疫情给人类带来了异常惨痛的回忆。今年的新型冠状病毒肺炎更是让我们感受到了动物源性病毒对人类健康、经济、生活造成的巨大危害。传统高通量测序技术在这些重大传染病检测和诊断中都发挥了重要作用,但是对于低滴度、复杂背景样本的检测比较困难,宿主基因组在核酸样品中占比呈压倒性,容易造成建库时扩增偏倚,低滴度病毒测序覆盖度较低甚至造成检测不到;新型病毒基因组与已知病毒序列库匹配程度较低,常规的核酸比对可能会遗漏掉相似度较低的序列,从而造成漏检。对于低滴度的病毒样本,往往无法通过直接核酸测序得到全序,初次筛查得到的序列只有一部分,不能满足常规全基因组扩增的需求,而新型病毒与参考序列匹配程度低,无法通过参考序列进行引物设计。基于对这些复杂条件下病毒全基因组测序的需求,本论文对传统高通量测序方法进行改良,探索不同动物样本中针对低滴度或与已知序列同源性较低的病毒全基因组测序的方法,为复杂情况下的病毒的全基因组测序提供一种新的思路。具体研究内容如下:新型动物源性病毒的检测。Ion S5测序平台进行高通量测序后,利用我实验室自主研发的新型病原体归类分析软件分析测序所得的海量数据:将高通量测序所得序列进行过滤除去低质量部分,然后对测序覆盖度进行均一化处理,并将得到的序列与NCBI上下载得到的所有病毒蛋白库进行比对,将其中病毒相关的序列再进行二次比对,先与病毒核酸序列库比对得到病毒分类结果及相似度,剩余未匹配到核酸序列库的序列再与病毒蛋白库进行比对,以此可明显减少遗漏,发现新型病毒。利用上述方法,本文对2018年采集的一批来自于我国云南省腾冲市牧民家中饲养的牛、羊血清样本进行检测,从中分别检测到不同的新型丙型肝炎病毒,与已知病毒的核苷酸相似程度较低,且首次出现在我国云南地区,丰富了边境地区病毒的多样性。复杂情况下的全基因组测序及生物信息学分析。对于牛羊血清样品中新发现的丙肝病毒,利用荧光定量PCR技术,确定包含新型病毒的核酸样品中新型病毒丰度较低,且核酸序列与已知序列差别较大,很难利用传统反转录后PCR扩增的方法测定序列。本论文对反转录方法进行改进,利用新型的反转录酶,将一段已知序列引入c DNA的末端作为引物,根据已得到的序列设计引物进行PCR扩增,对于丰度较低的病毒,增加扩增的循环次数,得到的高通量测序数据结合我实验室序列分析平台,运用生物信息学技术得到全基因组序列。对新型丙肝病毒进行系统发育分析,发现牛血清中发现的丙型肝炎病毒是牛丙型肝炎病毒的一个新的亚型,并且是该基因型中唯一测得全基因组序列的病毒株;羊血清中发现的丙型肝炎病毒为国内首次报道,并且为一个新的基因型。本研究促进了对边境地区病毒多样性的理解。利用上述方法,本文还对2018年8月取自于广东清远发生母猪流产疫情的某猪场的一批样本进行测序与分析,样本取自病猪心、脑组织,经过匀浆、过滤提取得到核酸。利用已知的长1375bp的序列,与PRRSV strain HENZMD-9(登录号为KU950374.1)进行BLAST比对,相似度最高为96%。以HENZMD-9为参考序列设计扩增引物,以新型反转录酶反转录得到的c DNA为模板进行PCR扩增,文库构建后利用高通量测序平台得到数据,拼接后得到初步的不完整序列,以得到的序列为参考设计扩增全基因组序列的引物。高通量测序后对数据进行拼接,对病毒全基因组序列进行生物信息学分析并构建系统发育树。此PRRSV的测得验证了低滴度病毒的全基因组测序方法的可行性。