【摘 要】
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抗生素具备良好的抑菌、杀菌活性,不规范的使用抗生素会诱导细菌发生变异而产生耐药性,威胁公共卫生安全。因此,对抗生素替代物的研发成为当前亟待解决的问题之一。抗菌肽具有丰富的种类、高效的抗菌活性而拥有广阔前景。鸡β防御素-13（Gal-13）和鸡颗粒溶素（GNLY）是鸡体内的天然抗菌肽,有广谱抗菌活性、热稳定性等特点。现阶段,抗菌肽合成存在提取和纯化这一难题,使得工业化生产难以实现。而促进重组抗菌肽在
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抗生素具备良好的抑菌、杀菌活性,不规范的使用抗生素会诱导细菌发生变异而产生耐药性,威胁公共卫生安全。因此,对抗生素替代物的研发成为当前亟待解决的问题之一。抗菌肽具有丰富的种类、高效的抗菌活性而拥有广阔前景。鸡β防御素-13（Gal-13）和鸡颗粒溶素（GNLY）是鸡体内的天然抗菌肽,有广谱抗菌活性、热稳定性等特点。现阶段,抗菌肽合成存在提取和纯化这一难题,使得工业化生产难以实现。而促进重组抗菌肽在异源宿主的表达技术将解决其工业化生产问题成为可能。黑曲霉因具备高效外分泌异源蛋白质特性,其表达产物安全性高,可作为饲料添加成分得到应用。异源蛋白在黑曲霉表达时,对异源蛋白氨基酸序列进行偏好性密码子优化,以及促进黑曲霉高效表达的内源蛋白与异源蛋白融合表达是常用方案。本课题将Gal-13和GNLY符合黑曲霉基因编码偏好性进行密码子优化,随后分别与p SZHA6R-Xyn B融合表达而构成2株重组菌株,受体菌均为黑曲霉（TH-2）,通过探究融合蛋白联合密码子优化对黑曲霉分泌表达Gal-13和GNLY的影响,实现鸡源抗菌肽在黑曲霉高效表达并保留抑菌活性,从而为抗菌肽工业化生产奠定基础。主要研究成果如下:（1）黑曲霉重组菌株的构建与筛选黑曲霉编码偏好性对Gal-13和GNLY基因序列进行密码子优化后,将其与p SZHA6RXyn B连接重组,构建重组表达载体p SZHA6R-Xyn B-Gal-13-M和p SZHA6R-Xyn B-GNLY-M,然后通过农杆菌冻融法将两个重组表达载体转化入TH-2,得到2株重组菌株GA、GN。（2）黑曲霉重组菌株表达Gal-13与GNLY的检测结果将GA、GN分别接种到发酵培养基中进行摇瓶发酵,在第4-11天的发酵上清和菌丝中均检测到Gal-13与GNLY的基因表达。发酵上清在Tricine-SDS-PAGE、SDS-PAGE检测中,可以在4.8、14.5 KD位置观察到目的条带。此外,ELISA检测发现Gal-13、GNLY的蛋白浓度在第11天达到最高,分别为54.20、73.65μg/m L。对菌丝的RT-q PCR检测到相似的结果,Gal-13与GNLY的转录水平在发酵的第4-11天存在显著的提升。上述结果表明,黑曲霉重组菌株GA、GN能够分别高效表达Gal-13与GNLY。（3）黑曲霉重组菌株的生长状态以及非折叠蛋白检测结果以TH-2为对照,检测黑曲霉重组菌株p SZHA6R-Xyn B-Gal-13-M以及p SZHA6R-Xyn BGNLY-M在发酵固体培养基的生长状态,发现2个重组菌株和TH-2的生长情况并无差异。非折叠蛋白响应（UPR）的检测结果显示GA、GN菌株的bip A、pdi A、hac A的m RNA转录水平显著高于对照,但在发酵4-11天内无显著差异,上述结果表明,非折叠蛋白响应参与了重组菌株目的基因的表达,但是对2个重组菌株没有生长抑制。（4）黑曲霉重组菌株表达的Gal-13和GNLY抑菌活性鉴定对2株表达的重组菌株上清液进行抑菌范围测定和MIC测定。抑菌范围测定结果表明,GA的抑制能力由强到弱是,大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。GN的的抑制能力由强到弱是沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。在MIC检测中,GA对大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌以及金黄色葡萄糖球菌的MIC分别为38.74、42.62、56.73、51.57μg/m L。GN对大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌以及金黄色葡萄糖球菌的MIC分别为46.48、38.41、51.13、42.25μg/m L。说明黑曲霉分泌表达的Gal-13和GNLY对大肠杆菌、沙门氏杆菌、枯草芽孢杆菌以及金黄色葡萄球菌均有抑菌活性。
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