中和性抗体在阻断和清除流感病毒的感染中发挥着重要的作用。然而目前的血清学方法在检测抗高致病性流感病毒H5N1的中和抗体反应时有很多的局限性。传统的血凝抑制实验方法敏感度较低,并且不能直接测抗体中和病毒的作用；微孔板中和实验配以western blot检测是目前最为标准的方法,但是这种方法需要劳动量比较大,而且操作者需要接受系统的培训才能使检测结果较为客观准确。另外,由于这两种方法需要用野生型病毒,对于高致病性流感病毒H5N1来说则要在生物安全3级以上实验室才能完成,这限制了该方法的广泛使用。因此,需要开发出一种安全有效、敏感度高、客观性强、特异性好而且可以量化的检测抗高致病性流感病毒H5N1的血清学诊断方法。本论文的第一部分,我们建立并优化了用流感病毒H5N1的红细胞凝集素(HA)和唾液酸苷酶(NA)包被的慢病毒载体假病毒系统,并以此包装出了一系列的流感病毒H5N1、H1N1和H3N2的假病毒库。对包装出的流感假病毒特征进行了研究,发现假病毒释放和进入细胞的机制模拟了野生型流感病毒。用小鼠和雪貂免疫血清,我们建立了一个基于假病毒的中和抗体检测方法。研究发现假病毒中和抗体检测方法具有很好的特异性和可量化性。用假病毒中和抗体检测方法、微孔板中和抗体检测方法和血凝抑制检测方法在临床相关的人类抗H5N1疫苗的雪貂动物模型中对雪貂免疫血清的中和抗体活性进行了分析,结果表明这三种方法检测的血清中和抗体活性具有良好的相关性,并且假病毒中和抗体检测方法比另外两种方法具有更高的敏感性。因此我们建立的假病毒中和抗体检测方法具有特异性好、敏感度高、可量化等优点,同时该方法不使用野生型H5N1病毒,因此不需要在生物安全3级实验室中进行操作,提高了安全性。　　 季节性流感疫苗能否诱导出抗具有潜在大爆发能力的流感病毒的亚型间交叉反应这一问题对于人类流感疫苗的接种和储备具有重要的指导意义。但对这一问题的研究大多数集中在疫苗诱导的T细胞交叉反应活性方面,对诱导的中和抗体交叉反应活性的研究却比较少,并且所得到的结论也不尽相同。其主要因为为目前使用的血清学方法的敏感度不够,不能检测到较低的中和抗体交叉反应活性。所以在建立了更为敏感的假病毒中和抗体检测方法以后,本论文的第二部分我们利用该方法对这一问题进行研究。为此我们招募了12个健康的志愿者,对志愿者接种季节性流感疫苗前后的血清抗不同分枝高致病性流感病毒H5N1、H1N1和H3N2的中和活性进行了分析,实验结果清楚地显示季节性流感疫苗可以诱导抗H5N1的亚型间交叉中和抗体反应活性。我们进一步利用小鼠模型评估了季节性流感疫苗对.H5N1的保护作用,结果显示季节性流感疫苗诱导的免疫反应对H5N1的感染具有部分保护作用,该保护作用与交叉中和抗体活性具有一定的相关性。　　 接种疫苗是预防高致病性流感病毒H5N1大流行的有效途径,但是由于H5N1可以杀死鸡胚,因此传统的基于鸡胚制备流感疫苗的方法在制备抗H5N1的疫苗时会对疫苗的产量造成很大影响。目前一些研究结果表明用类病毒颗粒(VLP)作为抗H5N1的疫苗具有较好的应用前景。但是由于H5N1病毒变异速度较快,所以设计出可以诱导交叉保护活性的疫苗是需要解决的重要问题。本论文的第三部分是研究由VLP诱导的中和抗体的交叉反应性。为此我们制备了三种表达高致病性流感病毒H5N1的HA和NA的类病毒颗粒(VLP):第一种VLP表达分枝1 H5N1 A/Thailand/1(KAN-1)/04的HA；第二种VLP表达亚分枝2.3H5N1 A/Shenzhen/406H/06的HA；第三种VLP同时表达分枝1 H5N1A/Thailand/1(KAN-1)/04和亚分枝2.3 H5N1.A/Shenzhen/406H/06的HA；这三种VLP表达相同的N1NAA/Thailand/1(KAN-1)/04。用这三种VLP分别免疫Balb/c小鼠,并用假病毒中和抗体检测方法对小鼠血清的中和抗体活性进行检测。结果表明:VLP可以引起较好的中和抗体反应；表达分枝1 HA的VLP免疫的小鼠血清对分枝1和分枝0的假病毒具有较好的中和活性,但对亚分枝2.1和亚分枝2.3的假病毒中和活性较弱；表达亚分枝2.3 HA的VLP免疫的小鼠血清对亚分枝2.1和亚分枝2.3的假病毒中和活性较好,对分枝0的假病毒中和活性较弱,对分枝1的假病毒中和活性最差；但同时表达分枝1 H5N1A/Thailand/1(KAN-1)/04和亚分枝2.3 H5N1 A/Shenzhen/406H/06的HA的VLP免疫的小鼠血清对分枝0,分枝1和分枝2等8个从人类患者中分离的H5N1的假病毒中和活性均较好,同时该组血清对H1N1也具有较好的中和活性；免疫后第140天获得的小鼠血清仍旧维持了较好的中和活性。这些研究结果表明,表达两种不同分枝H5N1 HA的VLP可以诱导出抗多种H5N1的中和抗体反应。　　 从以上工作本论文主要得到以下结论:　　 1)优化了慢病毒载体包装高致病性流感病毒H5N1的条件,发现当HA:NA在4:1时可以得到最好的假病毒效价；　　 2)对H5N1假病毒的生物学特性进行了研究,发现该假病毒模拟野生型病毒的释放和进入细胞的过程；　　 3)构建了流感病毒的假病毒库,利用该假病毒库可以进行交叉抗体中和活性分析和其他方面的研究；　　 4)建立了假病毒中和抗体检测方法,该方法的检测结果与传统方法的检测结果有极好的相关性,并且比传统的血清学检测方法具有更高的敏感性；　　 5)在人类和小鼠中评估了季节性流感疫苗诱导产生的抗高致病性流感病毒H5N1的中和抗体交叉反应活性,并对交叉反应活性与免疫保护之间的相关性进行了研究。我们发现季节性流感疫苗可以诱导产生较低的抗H5N1的中和抗体交叉反应活性,并在小鼠抗H5N1病毒的感染中具有部分保护作用。　　 6)在小鼠中评估了VLP的免疫原性和中和抗体交叉反应性,我们发现VLP可以引起较好的中和抗体反应活性,同时表达分枝1和亚分枝2.3 H5N1 HA的VLP可以诱导产生抗多个分枝H5N1的中和抗体活性。