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丝氨酸羟甲基转移酶(Serine hydroxymethyltransferase, SHMTs, EC:2.1.2.1)是5-磷酸吡哆醛(PLP)依赖的天冬氨酸转移酶类超家族酶Ⅰ类折叠型成员,广泛存在于真核生物、原核生物和古细菌中。在酶的同源异途进化过程中氨基酸序列高度保守,同时却有底物的多样性。SHMT的主要功能是催化丝氨酸和四氢叶酸向甘氨酸和Ns,N1o-亚甲基四氢叶酸的可逆转化。该反应是一碳单位的主要来源,参与神经递质、胸苷酸、嘌呤类衍生物和甲硫氨酸的合成。SHMT在植物的光氧化呼吸作用、癌细胞的调控、抗逆抗病虫害方面有重要作用,并已成为一种研究酶的催化机制以及蛋白结构调控机制的模式酶。家蚕丝由丝素和丝胶构成,丝素以甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸的含量为最多。家蚕体内合成甘氨酸的酶系活性比合成丙氨酸的酶系活性高,这与家蚕丝素中甘氨酸含量最高的特点相一致。丝氨酸羟甲基转移酶的生理底物是甘氨酸和丝氨酸。研究家蚕丝氨酸羟甲基转移酶基因(BmSHMT)有助于深入理解家蚕合成丝蛋白时的氨基酸供应机制。主要研究结果如下：I.BmSHMT基因的生物信息学分析及表达特征利用从NCBI上下载的人细胞质型SHMT氨基酸序列检索家蚕基因组数据库,预测得到了候选基因BGIBMGA007079-TA,将其命名为BmSHMT,将BGIBMGA007079-TA氨基酸序列重新在NCBI中进行BLASTP,发现NCBI中关于BmSHMT基因序列只有一条报告,序列号为NP001040279.1。利用BioEdit软件预测BmSHMT基因的ORF序列,得到长度为1398bp的全长序列。BmSHMT基因定位于家蚕第17号染色体的nscaf2865上,由7个外显子和6个内含子组成,共编码465个氨基酸,理论分子量约为53kDa,等电点pI为7.56。结构域预测显不BmSHMT蛋白序列含有SHMT家族结构域,无信号肽和跨膜区。利用ClastalX软件将BmSHMT与已报道的SHMT家族成员进行氨基酸序列比对,然后使用MEGA5软件构建系统进化树,运用GENEDOC软件导出氨基酸序列比对结果。结果显示,构建的进化树大致分为4大簇,昆虫、哺乳动物、植物以及原核生物分别聚为一簇,家蚕BmSHMT基因和黑脉金斑蝶SHMT基因同源性最高。氨基酸序列比对结果显示SHMT在已选物种中具有较高的序列保守性。利用qRT-PCR对BmSHMT基因不同组织和不同时期的表达特征进行分析,发现：BmSHMT基因在家蚕表皮、脂肪体和丝腺,尤其是后部丝腺中表达量很高。SHMT基因在872品种后部丝腺的表达量比前中部丝腺高,并且这种差异与大造品种相比更加明显。SHMT基因在Nd品种整条丝腺中的表达量与872和大造品种前中部丝腺的表达水平接近。BmSHMT基因在食桑期的表达量比眠期高。BmSHMT基因在家蚕五龄前期表达量高,且呈逐渐降低的状态,在预蛹期表达量又变高。对BmSHMT基因的5’上游2kb长度的核酸序列进行分析,发掘影响BmSHMT基因的相关因素。启动子序列分析和转录因子结合位点预测发现BmSHMT基因上游无典型的TATA盒和CAAT盒,无CpGF岛。转录因子结合位点大概分为三类：细胞生长分化因子、应急胁迫和免疫相关的因子以及激素调控因子。HSF转录因子多次重复出现,BR-C Z转录因子也得到关注。2.家蚕BmSHMT基因的全长克隆、原核表达纯化及多克隆抗体制备以从家蚕大造品种的五龄3天脂肪体中提取的总RNA反转录的cDNA为模板,克隆得到1398bp的全长序列。构建融合蛋白表达载体BmSHMT-pET28a,在BL21(DE3)表达菌株中表达,经16℃,20h诱导表达出可溶的BmSHMT重组蛋白。重组蛋白经过镍柱纯化,在200mM咪唑浓度下可以洗脱得到较纯的目的蛋白,进一步经过分子筛纯化和30K超滤管浓缩,获得了纯度约90%的蛋白,送制兔抗BmSHMT商业化多克隆抗体,制备的抗体效价为1：100000。3.BmSHMT的Western blot验证和亚细胞定位使用制备的BmSHMT多克隆抗体,通过western blot在蛋白水平上验证BmSHMT的组织差异性。结果显示BmSHMT在丝腺和脂肪体中表达量较高,这与qRT-PCR结果一致。在中部丝腺和后部丝腺进行BmSHMT的免疫荧光定位,与对照相比,后部丝腺的荧光信号明显强于中部丝腺。4.家蚕BmSHMT的酶活检测SHMT的基本功能是催化丝氨酸和四氢叶酸向甘氨酸和Ns,N1o-亚甲基四氢叶酸的可逆转化。根据实验室条件选择分光光度法测定BmSHMT的酶活。检测方法如下：在30℃,pH为8.5的反应条件下将BmSHMT和亚甲基四氢叶酸脱氢酶2(BmMTHFD-2)偶联起来,检测NADPH的吸光度在340nm(消光系数为6.22mM·L-1·cm-1)处1min内的变化,进而间接计算出BmSHMT的酶活。Ser和THF的最大浓度分别为5mM和400μM,并建立一系列底物浓度梯度,测定L-Ser和THF的Km值。酶活测定结果显示,当BmSHMT的酶浓度为0.002mg/mL,MTHFD-2的蛋白浓度为4mg/mL时,BmSHMT的酶活为1.32±0.26μM·min-1·mg-1。利用Origin软件根据米氏方程推导出Km L-serine为0.52±0.23mM,Km THF为0.07±0.04mM。BmSHMT的酶活测定结果和已有报道的其他物种SHMT的酶活比较后发现,其和人类细胞质SHMT型的酶活相当。5.家蚕BmSHMT的定点突变及酶活测定比较家蚕和人细胞质型SHMT(HcSHMT)的氨基酸序列,并查阅已有的SHMT突变研究相关的文献报道,选择有研究意义的突变位点。通过一步定点突变法和重叠PCR法对BmSHMT的特定位点进行定点突变,获得BmSHMT(H132D)和BmSHMT(P246C)等突变体。对其测定酶活发现,它们的酶活均为0.32±0.08μM·min-1·mg-1,明显低于野生正常型BmSHMT的酶活。PBS缓冲液(pH8.2)中,BmSHMT(H132D)蛋白的颜色在7mg/mL时并不呈现出正常型BmSHMT具有的黄色,说明132位组氨酸突变后PLP辅因子无法和BmSHMT正常结合。