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目的:筛选肺鳞癌诊断和转移复发预警的肿瘤标志物;验证差异性蛋白质甘油醛三磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的可靠性,探求GAPDH在肺鳞癌中异常表达的可能机制。
方法:应用荧光定量差异凝胶电泳(two-dimensional differential in-gelelectrophoresis,2D-DIGE)技术,比较临床肺鳞癌患者肿瘤组织和与其配对的癌旁正常肺组织、肺鳞癌患者转移组织(M)与未转移组织(N)之间的蛋白质表达谱的差异;经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定;辅助生物信息学技术对鉴定的蛋白质分析。应用Western Blotting和免疫组织化学法在临床肺鳞癌组织中验证GAPDH蛋白的表达,用肺鳞癌和食管鳞癌芯片扩大验证范围。
结果:应用2D-DIGE在7对临床肺鳞癌患者与其配对的癌旁正常肺组织标本中筛选出有统计学意义的差异性(P≤0.1)蛋白质点413个,有显著性差异(P≤0.05)的蛋白质点323个,其中上调204个,下调209个。
7对肺鳞癌患者中,未转移组(N)3对,转移组(M)4对。肺鳞癌组织与配对的癌旁肺组织比较有显著性差异(P≤0.05)的质点未转移组中215个,转移组中171个。二者共有的差异性质点175个,其中有显著性差异(N和M均为P≤0.05)的质点72个,我们认为这部分质点与肿瘤发生的关系更为密切。共有质点以外,只在未转移组中有显著性差异的质点50个(0.01＜p≤0.05且AR≥2.5,或者p≤0.01)。我们界定转移组中差异明显的质点(p≤0.1且AR≥2.5,或p≤0.01且1.5≤AR≤2.5),以及转移组与未转移组比较,差异比值超过1.5倍者为肺鳞癌转移特异性差异质点。其中有显著性差异(P≤0.05)的质点60个。
对上述差异性质点经MALDI-TOF-MS鉴定,其中96个差异性质点被有效鉴定出,涉及81种蛋白质。
81种蛋白质经PANTHER(Protein ANalysis THrough Evolutionary Relmionships)分类系统分别在分子功能、生物学过程、信号转导通路、细胞成分和蛋白分类方面进行分析。
综合肺鳞癌肿瘤组织与配对的癌旁正常肺组织比较时统计学的一致性(PairedT-test N)、差异倍率(AR)、质谱鉴定的得分值(Mascot Score),以及多点重复鉴定、蛋白质功能和生物信息学分析等因素,我们认为:
1.与肺鳞癌发生密切相关的蛋白质包括:①属于分子伴侣家族:内质网素(Endoplasrnin,HSP9081)、热休克同源蛋白71 kDa(Heat shock cognate71 kDaprotein,HSPA8)、热休克蛋白60(Heat shock protein60,HSPD1)、葡萄糖调节蛋白78 kDa(78 kDa glucose-regulated protein,HSPA5)和蛋白激酶C抑制蛋白1(14-3-3proteinzeta/delta,YWHAZ)。②具有催化活性:天冬氨酰tRNA合成酶(Aspartyc-tRNA synthetase,cytoplasmic,DARS)、甘油醛三磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase,TPI1)、延伸因子2(Elongation factor2,EEF2)、环指蛋白和锌指蛋白结构域包含蛋白1(RING finger and CHYzinc fingerdomain-containing protein1,RCHY1)、二磷酸核苷激酶B(Nucleoside diphosphatekinase B,NME2)、ρ-相关蛋白激酶1(Rho-associated protein kinase1,ROCK1)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和α-烯醇化酶(Alpha-enolase,ENO1)。③参与细胞蛋白运输:除了包含在具有催化活性以外,参与细胞蛋白运输的蛋白质有:纤维蛋白原β链(Fibrinogen beta chain,FGB)、过渡时期内质网ATP酶(Transitionalendoplasmic reticulum ATPase,VCP)、铁蛋白轻链(Ferritin light chain,FTL)和载脂蛋白A1(Apolipoprotein A-I,APOA1)。④细胞骨架蛋白:STX4相互作用蛋白(Syntaxin-binding protein4,STXBP4)和亨廷顿相互作用蛋白1(Huntingtin-imeracting protein1,HIP1)。⑤转移/载体蛋白:Golgin亚单位4(Golginsubfamily A member4,GOLGA4)。⑥结构蛋白:波形蛋白(Vimentin,VIM),角蛋白1、2、5、8、10、17和19(KRT1,KRT2,KRT5,KRT8,KRT10,KRT17,KRT19)。⑦有免疫和防御功能:血清淀粉样P成分(Serum amyloid P-component,APCS)。⑧未知功能蛋白:锚蛋白重复序列和SOCS盒蛋白(1Ankyrin repeat and SOCS boxprotein1,ASB1)、锌指MYM型蛋白2(zinc finger MYM-type protein2,ZMYM2)、L型gulonate3脱氢酶(L-gulonate3-dehydrogenase;Gul3DH,CRYL1)、未知功能蛋白C12orf28(Uncharacterized protein C12orf28,C12orf28)、线粒体内膜蛋白(Mitochondrial inner membrane protein,IMMT)和结节漏斗肽残留39(Tuberoinfundibular peptide of39 residues,TIPF39)。
2.与肺鳞癌发生有关但与肺鳞癌转移无明显相关性的蛋白质包括:①具有催化活性:DNA修复内切酶XPF(DNA repair endonuclease XPF,ERCC4)、GTP酶激活蛋白1(Rab GTPase-activating protein1,RABGAPI)、乙醇脱氢酶[辅酶](Alcoholdehydrogenase[NADP+],AKR1A1)、前体mRNA剪接因子19(pre-mRNA-splicingfactor19,Prpf19)、谷胱甘肽-S-转移酶P(Glutathione S-transferase P,GSTP)和羧酸酯酶(Liver carboxylesterase,CES)。②参与细胞蛋白运输:具有催化活性以外,参与细胞蛋白运输的蛋白质有:钾电压门控通道亚基4(Potassium voltage-gatedcharmel subfamily G member4,KCNG4)、膜联蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)和膜联蛋白A5(Annexin A5,ANXA5)。③细胞骨架蛋白:微管蛋白β-2C链(Tubulinbeta-2C chain,TUBB2C)。④未知功能蛋白:环指蛋白169(RING finger protein169,RNF169)和富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(Leucine-rich repeatserine/threonine-protein kinase2,LRRK2)。
3.与肺鳞癌转移密切相关的蛋白质包括:①具有催化活性:果糖二磷酸醛缩酶A(Fructose-bisphosphate aldolase A,ALDOA)和蛋白质二硫键异构酶A6(Proteindisulfide-isomerase A6,PDIA6)。②具有转录调节活性:锌指蛋白836(Zinc fingerprotein836,ZNF836)。此外,在上述与肺鳞癌发生密切相关的蛋白质中,EEF2、DARS、KRT10、KRT5、KRT2、KRT17、VIM、HBD、ROCK1在转移组中与未转移组中的差异倍率比较下调超过1.5倍;GOLGA4、VIM、C12orf28、APCS、FTL上调超过1.5倍。密切关注这些蛋白的变化,可能提示肺鳞癌患者容易向转移方向发展。
GAPDH在肺鳞癌组织与其配对的癌旁正常肺组织中有明显的差异(未转移组中差异7.11倍,p=0.011;转移组中差异3.46倍,p=0.0037)。Western Blotting验证结果为17对肺鳞癌组织中GAPDH的表达显著高于与其配对的癌旁正常肺组织(p=0.00018);免疫组织化学法验证结果为,GAPDH在10对肺鳞癌患者组织中的表达高于与其配对的癌旁正常肺组织。
75对肺鳞癌及其配对的癌旁肺组织芯片中GAPDH免疫组化法检测结果:①在肺鳞癌组织中的表达明显高于与其配对的癌旁正常肺泡上皮及细支气管上皮组织(p=2.5×10-27);②在肺鳞癌组织及癌旁正常肺组织浸润的淋巴细胞中表达阳性;③在未转移组中的表达为93.02％(40/43),转移组中为84.38%(27/32),未转移组中的表达较转移组高8.64%;④在1、2、3A期及3B和4期的肺鳞癌中的表达分别为88.89%(24/27)、96.43%(27/28)、76.47%(13/17)和66.67%(2/3),表明GAPDH的表达随着肿瘤恶性程度升高而下降;⑤在低分化、中分化和高分化中的表达分别为76.92%(10/13)、92.31%(48/52)和90.00%(9/10),表明GAPDH在恶性程度高的低分化肺鳞癌中的表达比中、高分化肺鳞癌中的表达低。
107对食管鳞癌及其配对的癌旁正常食管组织的组织芯片中GAPDH免疫组织化学法检测结果:①在食管鳞癌组织中的表达明显高于与其配对的癌旁正常食管上皮组织(p=1.54×10-21);②在正常食管鳞状上皮的基底层高表达,而表层无表达;③在肿瘤组织及癌旁正常食管上皮浸润的淋巴细胞中也高表达;④在未转移组中的表达为79.6%(39/49),转移组中为58.6%(34/58),未转移组中的表达较转移组高21%;⑤在低分化、中分化和高分化中的表达分别为62.5%(5/8)、66.7%(34/51)和70.8%(34/48),表明GAPDH在恶性程度高的低分化食管鳞癌中的表达比中、高分化中的表达低;⑥在髓质型和蕈伞型食管鳞癌中的表达分别为69.2%(45/65)和70.0%(28/40),其表达与病理类型无关。
比较96例2组配对的癌旁正常食管组织均保存完整(无脱片)的食管鳞状上皮中GAPDH在基底层表达以及淋巴细胞浸润与肿瘤转移的相关性,结果:①未转移组的癌旁正常食管鳞状上皮基底层中GAPDH的表达为67.4%(29/43),转移组为50.9%(27/53),未转移组较转移组高16.5%,该结果有无意义尚需探讨;②未转移组和转移组的癌旁食管上皮组织中淋巴细胞浸润的比例分别为65.1%(28/43)和64.2%(34/53),二者之间无差异。
结论:
1.应用高通量的2D-DIGE定量蛋白质学技术建立了临床肺鳞癌组织的蛋白质表达图谱。
2.有效鉴定出的81个蛋白质中,包括已知的与肺癌发生相关的蛋白质9种;与肺癌发生的关系尚需明确的蛋白质30种,其中DARS、HSP9081、HSPA8、HSPA5、FGB、STXBP4、GOLGA4、ERCC4、RABGAP1、AKR1A、Prpfl9、CES、KCNG4、ANXA5、nJBB2C、ZNF101和ZMAT1为我们首次提出与肺癌发生相关;PDIA6和ZNF836为首次提出与肺癌转移有关。还包括其功能尚无相关报道,有可能成为我们新发现的蛋白质9种:ASB1、ZMYM2、Gul3DH、C12orf28、IMMT、TIPF39、NUD7、RNF169和LRRK2。
3.GAPDH在肺鳞癌及食管鳞癌组织中表达上调。应用Western Blotting法检测同种组织的不同状态时GAPDH作为内参要慎重。
4.GAPDH在转移组和恶性程度高的低分化组中反而下调,提示,GAPDH上调可能为肿瘤发生的早期事件。
5.肿瘤组织中GAPDH高表达的机制可能为细胞过度增殖所致。