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弹性蛋白酶抑制剂能够抑制生物体内弹性蛋白酶的活性,治疗因弹性蛋白酶过度表达引起的胰腺炎、囊肿、病毒感染、肺气肿、肿瘤、炎症及损伤等。运用酶靶筛选模型,分子对接技术以及多光谱法对几种弹性蛋白酶抑制剂:人工合成并已临床应用的药物-西维来司钠,从天然植物提取的活性成分-去甲络石苷、络石苷以及从人体中提取的活性成分-乌司他丁展开抑制活性评价,并对几种抑制剂与弹性蛋白酶的相互作用进行研究,研究内容如下:通过建立酶靶活性筛选模型、运用酶反应动力学研究抑制剂的抑制作用,根据Lineweaver-Burk双倒数法,判断出人工合成并已临床应用的弹性蛋白酶抑制剂西维来司钠(ONO-5046)对弹性蛋白酶存在竞争性抑制作用,IC50=9.98μmol/L,Ki=13.50×10-6mol/L。以上结果表明,西维来司钠对弹性蛋白酶有较强的抑制作用。运用多光谱法及分子对接模型研究西维来司钠与弹性蛋白酶的相互作用机制,结果表明,西维来司钠与弹性蛋白酶的结合能力较强,可形成1:1的复合物,ΔH<0和ΔS<0表明氢键与范德华力为其主要结合作用力;西维来司钠的加入改变了弹性蛋白酶的二级构象,使氨基酸残基周围环境的极性增加、亲水性增加、疏水性降低,弹性蛋白酶的无规则卷曲比例升高,α-螺旋、β-折叠比例有所降低。分子对接结果表明西维来司钠与弹性蛋白酶之间存在氢键、范德华力、静电作用及盐桥作用等多种作用力,当分子骨架中有能与弹性蛋白酶氨基酸残基形成氢键的多个酰基基团、苯环,较长的共轭结构、疏水基团以及能与ARG形成盐桥作用的羧基负离子的存在,都有利于其与弹性蛋白酶的结合,形成稳定的复合物。络石藤木脂素活性单体能够在一定程度上抑制弹性蛋白酶的活性。以络石藤木脂素活性成分为研究对象,通过体外靶酶筛选模型和酶反应动力学,测定出络石苷对弹性蛋白酶作用的抑制常数Ki值及抑制类型,络石苷对弹性蛋白酶的抑制作用属于竞争性抑制,抑制常数Ki(络石苷)=2.40×10-3mol/L。同时,相同浓度的去甲络石苷抑制活力比络石苷弱。结合前期的工作基础,络石藤六种二苄基丁内酯类木脂素对弹性蛋白酶的抑制能力,从大到小依次为:牛蒡苷元、络石苷元、罗汉松树脂酚、去甲络石苷元、络石苷、去甲络石苷。为了明确二苄基丁内酯类活性成分对弹性蛋白酶的抑制作用及构效关系,采用分子对接技术,模拟活性单体与弹性蛋白酶的相互作用,进一步表明:苯环上酚羟基的O-甲基化对弹性蛋白酶抑制剂的抑制活性是有利的,苯环上4位酚羟基的O-糖基化,五元环8’位上连接羟基对弹性蛋白酶的抑制活性是不利的。乌司他丁(UTI)是一种从成年男性尿液中分离提取的蛋白酶抑制剂,能够对弹性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等多种水解酶的活性产生抑制作用。运用酶靶活性筛选模型测定出乌司他丁对弹性蛋白酶的抑制作用较强,IC50=22.50μmol/L,Ki=19.80×10-6mol/L,酶反应动力学研究表明其抑制类型为竞争性抑制。通过分析荧光光谱结果可知:乌司他丁与弹性蛋白酶的猝灭类型为静态猝灭,其主要结合作用力为氢键与范德华力。同步荧光光谱法、紫外-可见吸收光谱法、圆二色谱法及红外光谱法结果表明,乌司他丁改变了弹性蛋白酶中氨基酸残基的微环境并对其二级结构产生了影响。通过比较三类弹性蛋白酶抑制剂的Ki值及IC50值可知:西维来司钠的抑制能力最强,乌司他丁次之,络石藤木脂素活性单体最弱。从结构上分析:西维来司钠分子骨架中包含磺酰基、酰胺基、酯基、羧基以及2个苯环,多个酰基基团处在较长的共轭结构中,能够与弹性蛋白酶的氨基酸残基形成氢键,端碳上有3个甲基,分子间存在疏水作用,羰基中的氧负离子与弹性蛋白酶中带电荷的ARG存在盐桥作用。两者之间存在多种作用力,结合能力更强,抑制活性最好。而与西维来司钠相比,络石藤二苄基丁内酯类木脂素虽然具有苯环、酚羟基、甲氧基和环内酯等结构,但其共轭结构短,作用位点的个数少,作用力弱,所以抑制活性相对弱。以上结论为新型弹性蛋白酶抑制剂的设计、合成、修饰和改造提供参考。