干细胞在成年哺乳动物体内干细胞分布广泛,目前已经发现在多种组织器官中广泛存在。最近的研究表明,雌性生殖干细胞存在于在几个物种之中,然而他们的起源和功能还不是很清楚,而且他们的成卵潜能和对卵泡形成的贡献仍然缺少有力的证据。2009年,Zou等(Zou et al.,2009)从幼年和成年小鼠卵巢中分离得到的了具有增殖能力,并且有生殖特异性的雌性生殖干细胞。但是没有证据证明这些分离得到的雌性生殖干细胞参与了卵泡形成,卵子发生等活动。虽然雌性生殖干细胞的研究尚不够深入,但是探索其增殖分化机制及成卵等生理活动将有助于我们对卵巢早衰、不孕不育等疾病的认识。雷帕霉素作为mTOR通路的抑制剂,可以抑制原始卵泡的发育,减少原始卵泡的消耗,从而有助于卵子库及卵巢生殖能力的维持。目前的研究主要集中于雷帕霉素对原始卵泡激活的抑制作用,但是雷帕霉素对小鼠卵巢及小鼠雌性生殖干细胞增殖、分化及多能性等方面影响的研究还很少。随着雷帕霉素在卵巢中作用机制的不断探索,将会在延缓卵巢衰老方面带来新的应用前景。本研究中,我们的目的是采用与Zou等不同的方法得到小鼠雌性生殖干细胞,并且探索雷帕霉素对小鼠卵巢及小鼠雌性生殖干细胞增殖、分化及多能性方面的影响。实验结果表明:我们通过消化卵巢表层细胞,得到了具有多能性和生殖特异性的细胞,并且能够传代至第7代;对一月龄小鼠腹腔隔天注射雷帕霉素30 d,通过定量PCR和免疫荧光染色的检查,发现对小鼠卵巢及小鼠雌性生殖干细胞有促进增殖和抑制分化及多能性的作用。1.小鼠雌性生殖干细胞的分离培养及鉴定雌性生殖干细胞特异性表达多能性标记基因Oct4,并且定位在卵巢表面上皮及皮质表层。因此,我们用Oct4启动子驱动GFP表达的转基因OG2小鼠作为实验动物,通过消化OG2小鼠卵巢近表面的细胞,挑取克隆传代的方法,从而纯化并富集小鼠雌性生殖干细胞。最终,我们得到了稳定表达Oct4绿色荧光蛋白的细胞,并且传代达7次。碱性磷酸酶检测结果显示,克隆有AP弱阳性;而且细胞具有向三胚层分化的潜能,并具有较好的增殖能力。我们所得到的小鼠雌性生殖干细胞与雄性生殖干细胞、胚胎干细胞都有一定的共性。2.雷帕霉素对小鼠卵巢组织及小鼠雌性生殖干细胞的影响在小鼠卵巢中,已经有报道称雷帕霉素作为mTOR通路的抑制,可以抑制原始卵泡的激活。本实验中,我们试图探索雷帕霉素对小鼠卵巢及小鼠雌性生殖干细胞的增殖、分化及多能性等方面的影响。向一月龄ICR小鼠腹腔隔天注射雷帕霉素30 d,通过定量PCR和免疫荧光染色的检测,鉴定雷帕霉素对其增殖、分化及多能性的影响。实验结果初步表明,雷帕霉素不仅能够促进小鼠卵巢及小鼠雌性生殖干细胞的增殖,而且能够抑制其分化和多能性。