目的:异基因骨髓移植( Allo-gene bone marrow transplantation, Allo-BMT)是治疗恶性血液疾病、血液系统遗传性疾病、再生障碍性贫血等疾病的一种有效方法,不幸的是移植物抗宿主病(Graft versus host disease, GVHD)仍然是其主要的并发症,并且具有高发病率、高死亡率,严重限制了Allo-BMT的应用和发展。免疫抑制药物虽然能够有效的减少GVHD的发生,但治疗的同时会引起严重的并发症,诸如感染和增加白血病复发风险。对此许多学者已经在寻找开发一些治疗方法来防止GVHD的发生同时避免免疫抑制剂引起的并发症。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)是一种存在于骨髓中的非造血组织干细胞,具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力,可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞等。同时还具有支持体外造血,促进体内造血功能重建的作用。近来研究发现,MSC抗原提呈作用较弱,不表达MHCⅡ类分子和CD80、CD86等共刺激分子,在体外能够抑制混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction, MLR),说明MSC具有一定的免疫调节特性。因此,MSC移植在理论上可能具有预防急性移植排斥反应,降低GVHD的严重程度和发生率的作用。本研究拟采用大鼠骨髓MSC,系统探讨其对大鼠异基因骨髓移植后GVHD的影响。方法:1利用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法从SD大鼠骨髓中分离培养MSC并分析其基本的生物学特性,包括其形态特征、细胞周期、增殖特征、细胞表型(CD34、CD45、CD29、CD44、CD105特异性分子的表达以及MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86免疫原性相关分子的表达)和向脂肪、成骨细胞分化的多向分化潜能。2通过在混合淋巴细胞细胞培养体系(刺激淋巴细胞+反应淋巴细胞)中加入与反应淋巴细胞同源的MSC,体外检测MSC对T细胞增殖的影响,MSC与反应淋巴细胞的比例分别为2:5、1:5、1:10。3分析供者源性MSC对异基因骨髓移植后GVHD的影响。在给Wistar受鼠进行致死量60COγ射线照射预处理后6小时内输注SD供鼠的骨髓细胞,为诱导出GVHD,同时输注SD供鼠的T细胞。实验组受鼠接受骨髓和T细胞移植的同时共输注体外培养的SD供鼠的MSC,MSC与T细胞的比例分别为1:5、2:5、1:1。对受鼠进行临床GVHD评分,观察生存期及肝脏和小肠的病理改变。结果:1经过Percoll密度梯度离心法结合贴壁法培养的原代MSC主要以集落生长为主,形态呈纺锤样,首次传代时间为2周左右。传代之后细胞生长速度明显增快,经过2天的潜伏期后,出现3~4天的对数生长期,而后进入平台期,约6天左右传代,细胞的均质性明显提高。传至第15代时细胞出现老化。细胞周期分析显示,培养至第五代后的细胞绝大多数处于静止期(S+G2+M期)。流式细胞仪分析MSC的特异性表型结果显示:培养至第五代后的细胞高表达间充质干细胞表面标志CD29,CD44、CD105,不表达造血干细胞表面标志CD34、CD45;免疫原性相关标志MHCⅠ类分子低表达,MHCⅡ类分子和共刺激分子CD80、CD86不表达。在体外,应用特殊的诱导培养体系,可以使大鼠MSC向脂肪细胞和成骨细胞分化。2在混合淋巴细胞培养体系中加入与反应淋巴细胞同源的MSC能够抑制T细胞的增殖,不同MSC浓度组之间存在显著性差异(P<0.01)。双因素相关分析显示MSC对T细胞增殖的抑制能力与MSC和反应淋巴细胞比例呈正相关(r=0.942, P<0.01)。MSC与反应淋巴细胞比例为2:5时抑制作用最为明显,抑制率达到了(83.6±2.3)%,MSC与反应淋巴细胞比例为1:5,1:10时,抑制率分别为(60.6±3.3)%和(23.2±2.2)%。3异基因骨髓移植时,供鼠MSC与T细胞以比例1:5共输注后,受鼠GVHD评分为10分左右,与阳性对照组(GVHD评分为11分左右)相比无显著性差异(P>0.05),肝脏和小肠组织出现了严重GVHD病理改变,但生存期显著性延长(P<0.05);比例为2:5时,GVHD评分为8分左右,与阳性对照组相比存在显著性差异(P<0.05),肝脏和小肠病理只有轻微炎性改变,大鼠生存期显著延长(P<0.01);比例为1:1时,受鼠中只有20%出现了轻度GVHD症状,并且1~2周后缓解,其余大鼠均正常,GVHD评分仅1.4分左右,与阳性对照组相比有显著性差异(P<0.01),所有受鼠肝脏和小肠组织均未出现GVHD病理改变,并且长期生存(P<0.01)。结论: 1利用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法,可从SD大鼠骨髓中分离、扩增出一定数量并且纯度较高的MSC。其基本的生物学特性与干细胞相符。细胞免疫原性表型MHCⅠ低表达,MHCⅡ、CD80、CD86不表达,说明其抗原提呈作用较弱。2 MSC体外具有抑制T细胞增殖的作用,并且呈一定量效关系。3体内移植供者来源的高数量的MSC可降低异基因骨髓移植后GVHD的严重程度和发生率,延长受体的生存期。