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目的:为了准确评估机体的吞噬能力,探索吞噬功能缺陷相关疾病易感染的发生机制,本文基于16S rDNA建立一种能准确、客观、定量测定人体白细胞吞噬能力的方法,并用建立的方法对健康青年人及老年人的吞噬功能进行评价,确立了一个了判定全血白细胞吞噬能力的新指标,即细菌DNA变化率(CRD)。从特异性、分辨率、重复性等角度评价新方法的可靠性,并与临床常用的白细胞吞噬能力检测方法--显微镜法,进行相关性比较,保证新建立方法的准确性,以达到对机体基础免疫状态的客观评价。应用新方法对吸烟人群、临床慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)、糖尿病患者的总吞噬能力进行测定,同时基于白细胞计数对单个白细胞的吞噬能力进行评估,结合相关临床实验室指标来探讨疾病易感染的发生机制,并分析了机体患病与单个白细胞吞噬能力的关联,以期在细胞分子水平探讨临床疾病的发生与机体吞噬能力之间的关系。方法:1.采集临床实验室21例血培养阳性标本及12例血培养阴性标本,基于16S rDNA基因,采用实时定量PCR技术对培养瓶内的菌株进行检测,确定16S rDNA细菌通用引物的特异性,最小化检测阳性血培养和病原体检测之间的等待时间,量化实时定量PCR对于检测血培养瓶中病原体的敏感性。2.将细菌与全血白细胞孵育,基于16S rDNA细菌通用引物,采用实时定量PCR技术检测白细胞吞噬功能,以检测所得细菌DNA变化率(CRD)作为吞噬效果的指标。分五天在同一时间取一名健康志愿者全血五次与大肠埃希氏菌相互作用,以建立的新方法检测白细胞吞噬功能,验证其重复性。同时以传统显微镜法和新方法对健康青年组及老年组的白细胞吞噬率进行检测,比较健康青年组与老年组,及吸烟者与非吸烟者白细胞吞噬功能的差异,评估新方法的临床应用价值。3.采用新方法对64例非疾病选择性白细胞增高患者和59例健康体检者的白细胞吞噬功能进行检测,评估白细胞数量对吞噬能力的影响。分别收集20例COPD患者和健康体检者的全血,检测白细胞吞噬功能。根据总的中性粒细胞计数计算单个细胞的吞噬力,并对疾病组和健康组的白细胞吞噬能力进行比较。然后用Logistic回归,分析机体患病与单个细胞吞噬能力的关联。4.通过将全血白细胞与试验菌株孵育,模拟机体吞噬试验过程。分别对糖尿病患者的总的白细胞、中性粒细胞及单核细胞的吞噬率检测,对单个中性粒细胞、单个单核细胞的吞噬水平进行评估。并对可能影响细胞吞噬功能的因素进行分析及探讨。结果:1.16S rDNA细菌通用引物对于细菌检测特异性强,本实验所收集的21例血培养阳性标本包括10例革兰氏阳性球菌和11例革兰氏阴性杆菌,经过实时定量PCR对培养液DNA的检测,确定19例为阳性结果,Ct值范围在8.46-30.12之间,2例为阴性结果未检测到扩增曲线。12例血培养阴性标本中,1例检测显示明显的扩增曲线,其余11例无扩增曲线,结果为阴性。本实验中,实时定量PCR对于检测血培养标本的敏感性为91%。2.建立的实时定量PCR方法,对于白细胞吞噬率的检测,灵敏度高、客观性强、重复性好,且该方法与显微镜法对吞噬率的检测有显著相关性(R=0.818,p<0.01)。分五天在同一时间对一名健康志愿者的白细胞吞噬率检测,五次检测值分别为0.9754,0.9222,0.9410,0.9514和0.9094,均数为0.9399,标准差为0.0257,CV=2.7%,CV%<10。经独立样本t检验分析,检测样本中老年组的白细胞吞噬率明显低于青年组,两者的差异具有统计学意义(P<0.05)。3.基于对白细胞、中性粒细胞及单核细胞计数,以(细胞吞噬率(CRD)/相应细胞计数)为单个细胞吞噬率,进行吸烟者与非吸烟者组间比较。经统计学分析,仅单个单核细胞吞噬率在组间比较具有统计学差异(P<0.05),吸烟组低于非吸烟组。通过Spearman双变量相关性分析发现,白细胞吞噬率与吸烟年限呈显著性正相关(R=0.488)。4.白细胞增高组及COPD组的吞噬率显著低于其健康对照组(P<0.001),去除COPD组的实验室检测指标中白细胞及中性粒细胞计数异常(WBC<4.00×10~9/L或WBC﹥10.00×10~9/L;NEUT<2×10~9/L或NEUT﹥7×10~9/L)的试验样本CRD,发现COPD组与健康对照组中,采集样本的单个中性粒细胞的吞噬能力在组内具有显著差异(P<0.05),COPD组显著低于健康对照组。经Logistic回归分析发现,单个中性粒细胞吞噬能力及CRD与疾病密切相关(P≤0.05)。5.糖尿病组的白细胞、中性粒细胞和单核细胞及单个白细胞的吞噬能力均显著低与健康对照组(P<0.05),而单个中性粒细胞及单个单核细胞的吞噬能力在糖尿病组与健康对照组无显著差异。以糖尿病组和健康对照组的中性粒细胞及单核细胞的吞噬率作为交互变量,经Logistic回归分析,发现该两种变量不能产生交互效应,各自独立发挥作用,吞噬能力并不相互影响。结论:1.以16S rDNA细菌通用引物为基础,应用实时定量PCR技术检测白细胞吞噬能力,其方法准确、可靠、客观性强,具有潜在的临床应用价值。2.本实验建立的评价机体吞噬能力的新指标--细菌DNA变化率(CRD),发现这一指标在疾病患者中会降低,并且基于细胞计数,对单个细胞的吞噬水平进行了评估,可以结合总的白细胞吞噬率和单个细胞的吞噬水平对机体的吞噬能力进行全面评价,掌握固有免疫系统功能。3.该方法适用于测定吸烟人群、COPD、糖尿病等易感染风险的人群的吞噬能力检测,可用于评估机体的基础免疫状态水平。4.发现白细胞数量病态性增高,并不能引起机体的吞噬能力增强。其单个白细胞吞噬能力很可能由于疾病原因而下降。