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流感病毒属于正黏病毒科,为有包膜包裹的单股负链的RNA病毒。由流感病毒引发的流感疫情危害严重,目前以奥司他韦(达菲)为代表的抗流感药物面临严重的抗药性、机体副反应等问题,因而新型抗流感药物的研发意义重大。在我国对于流感的治疗很多中草药都达到了很好的效果,矮地茶是民间常用的中草药的一种,为紫金牛科植物紫金牛的干燥全株,具有止咳、抗病毒、止血、治疗慢性支气管炎等的作用,因此我们推测其成分可能具有抑制流感病毒的作用。我们的合作者从矮地茶中分离得到了一系列的组分:AJ-2、AJ-4、AJ-5、AJ-9、AJ-10、AJ-11、AJ-16。其中AJ-2属于黄酮类化合物,在植物的抗菌防病方面起重要作用。AJ-4~AJ-16的结构特征为含有脂肪酸链的苯环。为更好的研究矮地茶的抗病毒作用,本研究对这七种化合物进行了抗流感病毒效果及机制研究。首先构建了可用于抗流感化合物筛选的293T-IAV-Luc细胞系。该细胞系整合了流感病毒NP基因的启动子序列以及萤火虫荧光素酶报告基因序列。在流感病毒存在的情况下,报告基因被特异性启动表达,报告基因的表达水平可以反映流感病毒的复制水平,因而可以用于抗流感病毒化合物的筛选工作。利用该细胞系对矮地茶来源的化合物进行抗流感病毒效果的初筛,结果表明这七种化合物对流感病毒WSN毒株均具有抑制作用。进一步对这七种矮地茶来源的化合物的抗流感机制进行研究,结果表明:化合物A J-4、AJ-11、AJ-16能够通过抑制流感病毒与宿主细胞膜表面受体的结合抑制病毒的复制;化合物A J-5、AJ-10能够通过抑制HA介导的酸性条件下病毒与内吞体的膜融合影响病毒RNA释放到胞质,进而抑制病毒的复制;化合物A J-2能够通过抑制流感病毒聚合酶复合体的形成抑制病毒聚合酶复合体的活性,最终影响病毒的复制。除上述作用机制外,AJ-4、AJ-5、AJ-11、AJ-16对流感病毒的聚合酶复合体活性也有一定的抑制作用。这些研究为中药矮地茶的抗病毒机制研究奠定了基础,同时也为抗流感药物的研发提供了借鉴和参考。 本论文第二部分工作制备了流感病毒聚合酶碱性蛋白1(PB1)的多克隆抗体。流感病毒PB1蛋白是流感病毒聚合酶复合体的组分之一,在病毒的转录、复制及重配中发挥重要的作用。但是目前商品化的PB1蛋白抗体灵敏度不高,这给流感病毒PB1蛋白以及病毒聚合酶复合体的研究工作造成了不便。为更好地研究其功能,我们首次选取了PB1蛋白氨基酸序列的550-755段作为抗原免疫家兔,通过膜亲和纯化获得了灵敏度、特异性都较好的PB1蛋白多克隆抗体。同源比对结果表明该序列在不同亚型流感病毒中高度保守,Western Blotting结果也证明制备的抗体能够特异性识别流感病毒H3N2以及H9N2毒株的PB1蛋白。与商品化的PB1蛋白抗体比较结果显示,我们制备抗体的灵敏度要明显优于商品化的Santa I0303。这为进一步研究流感病毒PB1蛋白以及流感病毒聚合酶复合体奠定了基础。