【摘 要】
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细胞色素P450酶作为广泛存在于自然界的血红素单加氧酶,在药物代谢、异质生物解毒和类固醇生物合成方面发挥重要作用,其在温和条件下高选择性地催化有机化合物中C-H键羟基化反应的特性引起科学家们的广泛关注。大多数P450酶对氧化还原伴侣和昂贵的辅因子NAD（P）H的双重需求限制其在合成上的应用。虽然来自过氧化物酶家族的P450BSβ利用H2O2分流途径很好地解决这一问题,但该酶较高的底物特异性限制其作
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细胞色素P450酶作为广泛存在于自然界的血红素单加氧酶,在药物代谢、异质生物解毒和类固醇生物合成方面发挥重要作用,其在温和条件下高选择性地催化有机化合物中C-H键羟基化反应的特性引起科学家们的广泛关注。大多数P450酶对氧化还原伴侣和昂贵的辅因子NAD（P）H的双重需求限制其在合成上的应用。虽然来自过氧化物酶家族的P450BSβ利用H2O2分流途径很好地解决这一问题,但该酶较高的底物特异性限制其作为普遍使用的生物催化剂的应用前景。P450Bsβ的催化机制依赖脂肪酸底物的羧基与活性位点Arg242的胍基相互作用形成的盐桥,这是生成高氧化性中间体Compound Ⅰ和启动催化循环的关键。因此,不含羧酸基团的分子不能开启氧化循环,导致P450Bsβ对非羧酸底物几乎没有催化活性。目前通过添加诱饵分子的手段可实现高底物特异性酶对非羧酸底物的催化,但该方法仍存在底物范围狭窄、诱饵分子不易获取和竞争性抑制等问题。开发一个依赖酶内部一般酸碱对实现“自激活”的催化剂具有重要的应用意义。为此,本课题通过向蛋白质框架特定位点引入酸性官能团,代替底物羧基与保守的Arg242的胍基通过静电相互作用形成盐桥,以保证在对非羧酸底物的催化反应中酶自身实现Compound Ⅰ的形成。基于该策略的应用,我们成功获得了无需脂肪酸底物启动氧化循环的“自激活”突变体,打破了 P450Bsβ只能催化带有羧酸基团的天然底物的限制。经过进一步的突变筛选和助溶剂的优化,我们最终获得了 P450BSβ-Q85H/V170E/A246G/G290I这一突变体,该突变体通过廉价易得的H2O2即可以48.3%的转化率较为专一的催化6-苯己酸甲酯底物的苄基位氧化,且酮类副产物控制在10%左右。此外,该突变体成功将其底物范围扩展到一系列不同链长和携带不同官能团的其他非羧酸底物,为扩大P450酶的合成应用提供了理论和实验基础。综上所述,本研究通过定向进化和理性设计的手段成功改变了高底物特异性酶P450Bsβ的底物偏好,进一步推动该酶成为更为广谱的生物催化剂。
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