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本论文主要进行了大电导钾离子通道家族(SLO家族)和与PDZ结构域相结合的激酶(PBK)两方面的工作。钾离子通道是一种阳离子通道,它与细胞静息电位的形成具有密切的关系。在神经组织和兴奋组织中,它决定着兴奋电位的持续时间和兴奋频率。通常的钾离子通道只受电压调控,而SLO家族不仅受电压调控,还被其他因素如钙离子,钠离子,氯离子,pH值和磷酸化所调节。另外此家族的单一通道的通透性(即衡量在一定的膜电位下通过开放的通道流入的电荷的数量)也非常大,这些特性使得SLO家族在功能上区别于一般的钾离子通道。普遍认为,SLO通道C末端的两个RCK(调控钾离子通道电导)结构域赋予了SLO家族这些独特的性质。因此其三维结构的解析和研究,对于阐明其机理至关重要。
首先尝试表达人源SLO家族四个成员的C末端结构域,但是却没有得到可溶性的目的蛋白。随后尝试表达低等种属果蝇SLO家族成员dSLO1的C末端的结构域,通过筛选多种表达条件,最终获得了可溶性表达。但是该融合蛋白N端的MBP标签不能被PreScission(蛋白酶)切割。通过二级结构预测,将dSLO1 C末端的一段无规则卷曲去掉后得到dSLO1t基因,其在同样的表达条件下获得了较大量的可溶表达,且其标签可以被PreScission剪切。经过一系列的纯化后,得到纯度较高的dSLO1t目的蛋白,但是从纯化结果推测,dSLO1t目的蛋白是高度聚合的,因此并不适合结晶条件的筛选。
PBK蛋白的表达、纯化和结晶尝试是本论文的第二部分工作。PBK蛋白具有调控细胞进程的作用,它与肿瘤的发生有关,是治疗癌症的靶目标。因此解析PBK的三维结构、找出PBK行使作用的关键位点就显得非常地重要。
为了解析有活性的PBK的三维结构,用昆虫表达系统中表达了大量的有活性的野生型PBK和将第9位的苏氨酸突变为谷氨酸的PBKT9E。经过镍亲和层析柱、Superdex200的纯化后得到了高纯度、高浓度的PBK和PBKT9E。但是由于天然和突变体均存在状态不均一的现象,导致不能得到晶体。本部分工作仍在进行中。