近年对肿瘤微环境和肿瘤免疫逃逸机制的研究发现,一组介导免疫调节的负性分子——免疫卡控点(immune checkpoints),以B7家族负性共刺激分子:PD-L1(B7-H1)/PD-1、B7-H3、B7-H4为代表,其异常表达于一系列肿瘤组织和/或免疫细胞,参与肿瘤免疫逃逸,是构成肿瘤微环境的重要成分,并与肿瘤临床病理和预后密切相关。免疫卡控点,是指免疫系统固有的维持自身免疫耐受和机体免疫稳态、避免组织损伤、调节外周免疫应答的一类抑制性分子。在肿瘤微环境诱导下,肿瘤细胞利用特定的免疫卡控点分子来抵制机体内在的抗肿瘤免疫,特别是抑制肿瘤抗原特异性T细胞,这成为肿瘤免疫逃逸的主要机制。由于免疫卡控点分子需要与配体结合后才能活化,所以可以利用重组蛋白阻断或用抗体阻断其信号途径,使肿瘤微环境重新获得抗肿瘤的免疫力。更重要的是,抗免疫卡控点PD-1、CTLA-4及PD-L1单抗在多种肿瘤治疗中有显著疗效,使阻断免疫卡控点治疗策略在肿瘤免疫治疗中受到广泛关注,其中涉及的机制和关键分子将为肿瘤免疫治疗提供新的思路。胃癌是我国常见的严重危害健康的恶性疾病,亟待寻找和建立提高5年生存率的诊疗新方法。近年随着对免疫逃逸机制和肿瘤微环境的认识,以及肿瘤免疫逃逸关键免疫卡控点干预在临床肿瘤免疫治疗中取得的重大进展,免疫治疗已经成为最具发展前景的肿瘤干预策略。鉴此,采用先进的研究和诊断疗技术,整合多学科资源,以胃癌肿瘤区域微环境为切入点,探讨癌症演进不同阶段的机体免疫稳态失衡和肿瘤免疫逃逸涉及的关键细胞和免疫卡控点分子,探索新的治疗靶点和生物标志物,构建更有效的联合免疫治疗方案,具有重要的转化价值。本论文我们应用流式细胞术、免疫组织化学、酶联免疫检测分析和Real Time PCR等技术方法,对胃癌演进不同阶段和胃炎临床样本进行综合性的检测,结合胃癌的临床分型和预后综合分析,旨在探索1.胃癌演进过程中负性共刺激分子在肿瘤组织的表达规律;2.负性共刺激分子在胃癌临床病人的血液细胞、血浆、肿瘤组织的表达及临床价值;3.在此基础上检测了160例不同病理阶段胃癌组织,观察了免疫共刺激分子的表达及CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞的浸润,从而分析了对临床预后的影响。本研究选择具有重要干预价值的负性共刺激分子PD-L1、B7-H3和B7-H4为靶分子,综合性分析上述分子在胃癌组织演进不同阶段组织及外周血临床演进的表达规律、可能的临床意义,为免疫卡控点分子在胃癌临床演进不同阶段的作用提供有价值的参数,具有潜在的应用价值。第一部分负性共刺激分子PD-L1、B7-H3和B7-H4在胃癌发生发展不同阶段组织的表达目的:检测浅表性胃炎、萎缩性胃炎、低级别瘤变、高级别瘤变以及中早期胃癌病人标本中的PD-L1、B7-H3、B7-H4表达,分析其表达与胃癌演进的相关性。方法:收集经病理明确诊断的胃镜切除标本,浅表性胃炎、萎缩性胃炎、低级别瘤变、高级别瘤变各20例,以及中早期胃癌手术标本30例,通过免疫组织化学染色的方法,分析PD-L1、B7-H3、B7-H4分子在各种组织中的表达特点,统计学分析其表达的差异。结果:免疫组化结果显示:(1)PD-L1表达在炎症组织以及肿瘤组织,并出现随着肿瘤的演进表达增强趋势,在胃癌组织肿瘤边缘呈现强表达;但在胃癌组织,PD-L1在浸润炎症细胞中的表达远高于炎症阶段;(2)在浅表性胃炎、萎缩性胃炎中B7-H3分子几乎不表达,而在瘤变组织中,B7-H3开始表达并随着瘤变级别开始表达升高,而在胃癌组织中,B7-H3表达显著增加并在肿瘤组织、间质组织中呈广泛表达;(3)在炎症组织中B7-H4呈现在单个细胞,而在肿瘤组织和浸润的免疫细胞中都弥漫表达并表达增强。结论:PD-L1在炎症早期呈现表达,随着疾病进展呈增强趋势,在胃癌组织边缘呈强阳性表达;B7-H3在炎症组织中几乎不表达,在瘤变组织逐渐开始表达并在胃癌组织中表达增强;B7-H4在炎症组织中呈单个细胞表达,而在瘤变及胃癌组织中呈弥散表达。结果表明,免疫卡控点PD-L1、B7-H3和B7-H4的胃癌临床演进不同阶段的表达与局部炎症和免疫环境相关,值得进一步探讨。第二部分膜型和可溶性负性共刺激分子PD-L1、B7-H3、B7-H4在胃癌临床病人的外周血和肿瘤组织的表达及临床意义目的:探讨负性B7家族分子PD-L1、B7-H3和B7-H4在胃癌病人外周血细胞及对应的肿瘤组织的表达,检测可溶性PD-L1、B7-H3和B7-H4在外周血的水平,寻找不同组织/细胞之间的表达相关性,及分析不同表达细胞/类型的临床价值,进一步发掘外周血可溶性PD-L1、B7-H3和B7-H4作为可能生物标志物的价值。方法:流式细胞术检测术前术后外周血CD4、CD8、CD14细胞上负性共刺激分子PD-L1、B7-H3、B7-H4的表达;ELISA检测血浆中可溶性负性共刺激分子PD-L1、B7-H3、B7-H4的水平;免疫组化检测石蜡切片中负性共刺激分子PD-L1、B7-H3和B7-H4表达;Real-Time PCR检测新鲜组织中的细胞因子CCR7、CXCR4、IFN-γ、IL-4、IL-10、TNF-α等基因的表达。分析各指标的表达相关性及与病人病理资料的相关性。结果:(1)负性共刺激分子PD-L1肿瘤组织表达与IFN-γ的基因表达水平一致;肿瘤组织B7-H3的表达与血浆中可溶性B7-H3的水平呈正相关,血浆中可溶性B7-H3的表达与病人细胞增殖程度Ki67也呈正相关,而肿瘤组织中PD-L1和B7-H4的表达则与可溶性PD-L1及B7-H4无明显的相关性;(2)外周血细胞CD14+PD-L1+/CD14+B7-H3+/CD14+B7-H4+表达与PD-L1/B7-H3/B7-H4免疫组化表达以及可溶性PD-L1/B7-H3/B7-H4表达无明显的相关性。结论:PD-L1的免疫组化表达和IFN-γ的基因表达水平一致,这也显示IFN-γ与PD-L1表达存在调控作用;血浆可溶性B7-H3的表达与细胞增殖、B7-H3的组织表达呈正相关,提示肿瘤组织高表达的B7-H3可以以分泌型的形式分泌到血清中,可溶性B7-H3可能是具有潜在临床检测价值的生物标志,值得关注和进一步研究。第三部分负性共刺激分子PD-L1、B7-H3、B7-H4在胃癌组织的表达和CD8阳性T细胞、CD68阳性巨噬细胞在肿瘤组织浸润及其临床意义目的:检测160例胃癌病人标本中的PD-L1、B7-H3、B7-H4以及CD8、CD68的表达,探讨PD-L1、B7-H3、B7-H4与浸润的T细胞、巨噬细胞的表达相关性对胃癌病人生存的影响。方法:收集经病理明确诊断的胃癌手术组织160例,通过免疫组织化学染色方法,分析PD-L1、B7-H3、B7-H4、CD8、CD68分子在胃癌组织中的表达,统计学分析负性共刺激分子之间以及负性共刺激分子/CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞在肿瘤组织浸润的相关性,结合病人预后分析。结果:PD-L1、B7-H3、B7-H4三个指标联合应用能很好的预测病人预后,包括肿瘤分期(P=0.011)、远处转移(P=0.036)以及病人生存(P=0.000),都有显著的统计学意义,病人预后方面,三阳病人预后最差,三阴病人预后最好;PD-L1/CD8组合和病人的淋巴结转移有相关性(P=0.046),并且在CD8低表达的病例中,PD-L1表达高的更容易出现多淋巴结(大于4个)的转移;B7-H3/CD8、B7-H3/CD68的组合与病人死亡情况有显著相关性(P=0.003以及P=0.01),B7-H3低表达CD8或CD68高表达的病人预后显著好于其他病人,而与此相反,B7-H3高表达CD8或CD68低表达的病人预后显著差于其他病人;B7-H4/CD8、B7-H4/CD68的组合与病人的病理信息(年龄、性别、肿块大小、肿瘤分期、淋巴结转移、远处转移、死亡状况等)均无相关性,但B7-H4低表达,CD8或CD68高表达的病人的生存好于其他病人。结论:PD-L1、B7-H3、B7-H4三个指标联合应用能很好的预测病人预后,三阳病人预后最差,三阴病人预后最好;PD-L1与CD8的表达组合跟病人的淋巴结转移相关,PD-L1高表达、CD8低表达的病人容易出现多个淋巴结转移;B7-H3/CD8以及B7-H3/CD68组合均能很好的预测病人生存,B7-H3表达高CD8或CD68表达低的病人预后最差,B7-H3和B7-H4低表达而CD8或CD68表达高的病人预后最好。综上所述,在胃癌的演进过程中,PD-L1在胃癌组织中与IFN-γ的表达呈正相关,并且在CD8低表达的病人中能够增加淋巴结的转移,显示PD-L1与微环境细胞特别是与肿瘤浸润T细胞关系密切;在胃炎到胃癌的演进过程中,B7-H3呈从无到有、由弱到强的表达趋势,而在肿瘤中B7-H3联合CD8或CD68也能对肿瘤病人的预后进行准确判断,由以上结果可以看出B7-H3有望成为胃癌演进以及疾病发展过程中关键指标,对病人的疾病诊断、病情评估以及预后判断都有着重要的临床价值;在胃癌演进过程中B7-H4在肿瘤组织的表达有望作为疾病干预的靶点。