水稻矮缩病是我国水稻生产上重要的病毒病害之一,其病原物为水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV),由介体昆虫黑尾叶蝉以持久增殖型方式传播,并可经卵传播。病毒的经卵传播不仅有利于病毒在严寒等不利环境下的保存,同时也会增加子代昆虫的带毒比例,加重病害的流行和发生。病毒在介体昆虫中的垂直传播机制一直以来都是学科研究的热点和难点。本研究围绕RDV在其介体昆虫黑尾叶蝉中的经卵传播机制,探讨介体卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)、共生菌和RDV三者在病毒经卵传播过程中的相互作用,旨在揭示昆虫因子、内共生菌及植物病毒在经卵传播过程中的多元互作关系。本研究首先明确Sulcia和Nasuia在黑尾叶蝉雌性成虫中大量增殖,电镜和共聚焦观察发现Sulcia和Nasuia在入卵过程中首先粘附在黑尾叶蝉卵巢上皮鞘区域,随后通过类似膜融合的方式侵入上皮鞘区域,且在同一个上皮鞘滤泡细胞中可同时观察到Sulcia和Nasuia;最后Sulcia和Nasuia在上皮鞘中大量积累并逐步入卵,在初级卵母细胞中形成一个“菌球”。该研究结果明确了黑尾叶蝉中两种初级共生菌Sulcia和Nasuia在体内的分布、入卵时间及入卵路径均一致。已知Sulcia可以携带RDV经卵传播,根据Sulcia和Nasuia垂直传播路径一致,推测Nasuia可能也参与了RDV的经卵传播。随后通过共聚焦和电镜观察发现RDV会伴随两种共生菌Sulcia和Nasuia共同入卵,但RDV在两种共生菌的分布存在差异。RDV主要是粘附在Sulcia外膜上,而RDV则可分布在Nasuia内外膜的周质空间中,表明RDV同Sulcia和Nasuia的互作机制可能存在不同。通过酵母双杂交和GST Pull-down实验,发现RDV通过次要外壳蛋白P2与Sulcia OMP(Outermembraneprotein)互作粘附在Sulcia外膜上,通过主要外壳蛋白P8与Nasuia孔蛋白(Porin)互作。通过注射Nasuia Porin特异性抗体阻碍RDV与Nasuia的结合,可以明显降低RDV的经卵传播效率,但对Nasuia入卵的效率没有影响。由此表明RDV可以利用不同的机制同时借助Sulcia和Nalcia入卵,说明RDV、Nasuia和Sulcia已经进化出了复杂的三者互作方式。Vg是卵巢发育过程中主要的营养物质,是雌性昆虫羽化后特异性诱导表达的蛋白。通过免疫荧光观察表明:在黑尾叶蝉卵巢发育的早期,主要通过生殖区滋养细胞从血腔中摄取Vg,并通过营养丝输送至发育中的卵母细胞中。但在初级卵母细胞发育至绒毛膜发生期时,我们发现Vg 一条新的入卵途径-通过卵巢的上皮鞘区域输送入卵。推测可能是Vg入卵的一个辅助途径,有利于卵母细胞的成熟。有趣的是,Vg通过上皮鞘入卵的途径与共生菌入卵的途径非常相似。通过共聚焦和电镜同时对Sulcia、Nasuia和Vg三者入卵的过程进行观察,发现Vg上皮鞘区域输送入卵的过程中一直和Nasuia共定位,表明Vg入卵仅仅与Nasuia有关。进一步通过酵母双杂交和GST-Pull down实验证明Vg与Nasuia Porin存在特异性互作,而与Sulcia不存在互作。并且通过注射Nasuia、Sulcia和Vg抗体抑制Vg和共生菌间的互作,仅注射Nasuia和Vg抗体会显著降低Nasuia和Vg在血淋巴中的共定位。根据日本学者对叶蝉共生菌的研究,通过RNA干扰(RNAinterference,RNAi)抑制叶蝉Ncprp基因的表达,可以有效的抑制Nasuia的增殖,而对Sulcia增殖没有影响。因此通过dsNcprp特异性抑制Nasuia增殖时发现卵巢内Vg的含量也显著降低;同时利用RNAi抑制Vg受体(Vitellogeninreceptor,VgR)的表达,可以显著抑制VgR的表达和减少Vg在卵内的含量,但对Sulcia和Nasuia入卵数量没有影响。由此我们推测:Nasuia和Vg在共同入卵过程中是由Nasuia携带Vg入卵,而非Vg帮助Nasuia入卵。在此基础上,我们还对RDV、Nasuia和Vg在入卵时的定位情况进行了观察,发现无论是在卵巢外粘附的血淋巴细胞还是在卵巢的上皮鞘区域,RDV、Nasuia和Vg三者都完全共定位,推测Nasuia可以同时携带RDV和Vg入卵。综上所述,本研究首次阐明了在黑尾叶蝉中卵黄原蛋白-共生菌-水稻矮缩病毒三者在经卵传播过程中的相互作用关系,一方面明确了RDV通过两种外壳蛋白分别与共生菌Sulcia和Nasuia的互作,伴随共生菌入卵;另一方面发现了Vg由Nasuia携带从上皮鞘入卵的新通道;同时阐明了RDV、Nasuia和Vg三者相互作用共同入卵的机制。研究结果揭示了经卵传播过程中病毒-共生细菌-Vg间的三者互作关系,为探索昆虫体内寄主因子、内共生菌及植物病毒在经卵传播过程中的多元互作关系提供了重要的理论基础。