Reteplase（瑞替普酶）是临床上治疗血栓性疾病的代表性药物。当前商品化的Reteplase存在生产成本高、价格昂贵等问题，探索和研究新型、高效的表达系统是解决这一问题的关键。实验室前期尝试利用烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）载体表达系统和HFBI表达技术在烟草中表达Reteplase，但是产物的表达积累量较低。推测信号肽和密码子优化等两个因素是造成表达量低的可能原因。鉴于此，本研究从信号肽置换和密码子优化结果筛选等两个方面入手，明确不同来源信号肽和密码子优化结果对重组Reteplase在植物中表达作用;同时结合病毒编码的RNA沉默抑制子的作用特点，进一步优化了Reteplase植物病毒表达体系并探明其在植物中表达的时间变化规律;进而建立了重组瑞替普酶的下游纯化技术，对其纯化产物进行相关理化和生物学特性分析。　　在表达系统优化过程中，首先用生物信息学软件SignalP4.1对不同来源信号肽进行评价。设计并利用体外基因合成和亚克隆技术构建了2个Reteplase病毒表达载体，农杆菌渗滤法接种寄主植物本氏烟（N.benthamiana）后，对重组Reteplase在植物中的表达情况进行分析。结果显示，“植物源”Pr1b基因信号肽介导的重组Reteplase表达效率明显高于Reteplase基因“天然”信号肽介导的表达效率。其次，利用GeneOptimizer(R)程序分别按N.benthamiana和N.tabacum密码子使用频率对Reteplase编码基因的密码子进行了优化设计，并利用NetGene2软件对密码子优化后的基因序列进行了再评价。在此基础上，分别构建了相应的3个Reteplase病毒表达载体。接种植物后的结果分析显示，在不同接种浓度下，优化后序列的Reteplase表达效率明显得优于未优化的序列，因而密码子的优化是提高其表达水平的不可或缺的一步。第三，共接种烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）编码的RNA沉默抑制子(RNASilencingSuppressors，RSSs)HC-Pro可以有效的提高重组Reteplase在植物中的表达水平。共表达后的TMV病毒Reteplase表达系统最大表达量约为12.5μg/g鲜叶，最佳收取时间是接种后第9d左右。初步证明利用植物作为生物反应器表达重组Reteplase是可行性的。第四，在实验过程中发现，在烟草叶片上接种Reteplase的部位会有不同程度的坏死症状，而在空载体农杆菌对照和表达报告基因GFP的病毒表达载体的接种部位则未观察到坏死现象，且坏死症状的严重程度与重组Reteplase的表达量具有一定的正相关关系。初步推测，重组Reteplase对烟草植物细胞可能存在有细胞毒性，且细胞毒性与重组Reteplase在植物中的表达量有关系。　　在利用StrepⅡ标签技术纯化Reteplase的研究过程中发现，重组Reteplase在胞外的表达效率显著低于在内质网中的表达。此外，StrepⅡ标签位置对重组Reteplase在烟草中的表达效率也存在显著的影响。在结合缓冲液中加入Avdin会有效地抑制植物内源性生物素对StrepⅡ标签技术纯化造成的影响，进而提高重组Reteplase与亲和介质的结合效率。纯化的重组Reteplase样品经过SDS-PAGE和Western blots检测发现存在着“多带现象”，实验证明多余条带是重组Reteplase自身蛋白酶识别位点断裂后的产物。　　纯化产物的理化性质研究表明，纯化的重组Reteplase产物分子量为45.0kD左右，其分子量略大于原核表达的非糖基化Reteplase标准样品(39.0kD)。糖基化实验证明，分子量差异是由于Reteplase自身存在的2个糖基化位点所致。体外生物学活性结果显示，纯化的重组Reteplase可以产生明显的溶圈现象。结果表明，烟草中表达的重组Reteplase具有一定的生物学活性且其活性与原核表达系统表达的商品化Reteplase的生物学活性基本一致，证实利用植物病毒载体表达系统在烟草中表达重组Reteplase具有一定程度的可行性，同时为进一步提高重组Reteplase在植物表达系统中的表达奠定了基础。