目的:周围神经损伤后,缺损的替代修复是一直临床关注的热点,尚未得到完全解决。长期以来,自体神经移植被公认为修复缺损周围神经的“金标准”。但由于可供移植的自体神经有限,同时供区常常伴有不同程度的副损伤,而且容易造成供区感觉或运动功能障碍、创伤性神经瘤形成、手术难度大以及轴突生长错位等问题,因此,寻找一种理想的自体神经的替代材料修复缺损的周围神经成为近年来周围神经研究领域的焦点。然而,到目前为止,组织工程神经移植的效果还不是很理想,与自体神经移植的效果相比还有差距,如缺损的神经过长或较粗大,或为肌腱、骨外露等血供不良的创面时,修复效果不好。是因为组织工程神经移植区的再血管化延迟,在早期不能及时建立内在有效的血液循环,导致缺血缺氧,部分种子细胞死亡,神经再生的质量降低。因此,找到解决人工神经移植区血管化的有效方法是决定人工神经移植成功的关键因素之一。雪旺细胞(Schwann cells,SCs)作为周围神经系统的神经胶质细胞,是周围神经系统的髓鞘形成细胞,具有支持、保护、分隔、营养、趋化和促进再生的神经纤维成熟等主要功能,同时能够产生一些神经营养因子,通过多种途径作用于受损的周围神经,进而促进损伤神经功能的恢复,在周围神经损伤后的修复性再生过程中起着非常关键的作用。因而提高损伤局部雪旺细胞的增殖能力及数量能够更好地促进受损周围神经的功能恢复。血管内皮细胞(Vascular endothelia cells,VECs)为覆盖在血管内表面的单层扁平细胞,不仅是位于血液和血管壁之间的一个选择性通透屏障,而且是毛细血管重要组成部分。正常神经组织内血管较丰富,神经内膜内分布有毛细血管网,是神经组织与营养物质的桥梁,并保证神经纤维的生成和正常功能的发挥。本实验目的是以雪旺细胞和血管内皮细胞联合培养为组织工程人工神经血管的形成提供接近天然的条件,并进一步证明两种细胞联合培养能够在血管形成的基础上为雪旺细胞提供营养并促进其生长,同时找到两种细胞共培养的最适比例,进而尝试找到一种理想的促进组织工程人工神经血管化的方法,为最终实现组织工程人工神经移植的临床应用提供前期基础理论及实验依据。方法:1胎兔雪旺细胞的原代及传代培养取怀孕28天的新西兰白兔,耳缘静脉注入空气处死,常规消毒、铺无菌巾,迅速剖腹取胎兔,在无菌条件下取其坐骨神经,并去除神经外膜及束膜,Hank’s液冲洗5遍,剪碎,使用双酶消化法获取SCs,以双30min差速贴壁法及培养过程中先加入Arab-C(终末浓度为10-5mmol/l)去除和抑制纤维母细胞,后换成含NGF(40ng/ml)培养液促进SCs生长,每日在倒置显微镜下观察,培养后的第2代SCs用S-100抗体免疫细胞化学染色鉴定并计算其浓度,待细胞长满培养皿后可移除培养液,用胰酶消化后用细胞刮匙收集细胞于培养液中待用。2胎兔血管内皮细胞的原代及传代培养以相同方法取出胎兔,在无菌条件下,取出胎兔胸主动脉,PBS反复冲洗管腔内外,以传统的酶消化法获得VECs,在培养液中加入血管内皮生长因子(Vascular endothelia growth factor,VEGF)促进VECs增殖,每日在倒置显微镜下观察,培养后的第2代VECs用FⅧRA抗体免疫细胞化学染色鉴定并计算其浓度,待细胞长满培养皿后可移除培养液,用胰酶消化后用细胞刮匙收集细胞于培养液中待用。3雪旺细胞和血管内皮细胞直接共培养取传至第3代的胎兔SCs和VECs,将SCs与VECs以1:1、2:1、4:1的比例联合直接共培养于加入20%胎牛血清的DMEM及M199的混合培养基中,设为实验组A、B、C三组,同时将SCs单独培养设为对照组D。在两种细胞共培养的第1、3、5、7天时,进行SCs细胞计数并绘制其生长曲线,检测VECs对SCs的影响。结果:1雪旺细胞的培养结果观察体外培养的SCs约第7天爬满6cm培养皿。在倒置显微镜下观察:SCs形态多为梭形,有突起,双极,偶见三个细胞突起;细胞核明显,呈卵圆形;细胞呈端对端、肩并肩、旋涡状或栅栏状排列生长,并用S-100抗体免疫细胞化学染色证实为SCs;少量纤维母细胞呈“煎鸡蛋”样,胞体较雪旺细胞大,扁平状,外形不规则,突起短而多,核仁明显,约2到3个,颜色较雪旺细胞浅。2血管内皮细胞的培养结果观察每天在倒置显微镜下观察VECs生长情况:VECs初为圆形或椭圆形,立体感和折光性较强,数目不等成堆聚集,多呈小团集落,6～8天完全汇合形成连续的单层细胞,融合成片后外观呈特征性的“鹅卵石”样形态,排列致密,细胞质丰富;传代VECs个体较小,为短梭形、方形或多角形细胞,折光性小,细胞立体形态加强,镜下形成“铺路石”样改变,并用FⅧRA免疫细胞化学染色证实为VECs。3雪旺细胞与血管内皮细胞直接共培养的结果观察各组SCs数量随培养时间的延长而增加,其中在共培养第1天,各实验组与对照组细胞数量无差异(P>0.05),从共培养第3天起至第7天,实验组A(SCs与VECs比例为1:l)、C(SCs与VECs比例为4:l)细胞计数与对照组D有统计学差异(P<0.05),实验组B(SCs与VECs比例为2:l)与对照组D无明显统计学差异(P>0.05),而与其他两实验A、C组有显著差异(P<0.05)。结论:1在体外培养SCs过程中,使用双差速贴壁法可以去除大部分纤维母细胞,在细胞培养初期使用Arab-C能抑制纤维母细胞生长,后期培养液中加入NGF可促进SCs生长,从而获得大量的纯度达90%以上的SCs。2在体外培养VECs过程中,采用传统的酶消化法获取VECs,在培养液中加入VEGF可以促进VECs增殖,不仅抑制VECs在缺氧状态下的凋亡,还可有效抑制平滑肌细胞的生长,同时控制恰当的胶原酶消化的时间,从而获得大量的纯度达90%以上的VECs。3胎兔胸主动脉来源的VECs能在体外促进胎兔SCs分化增殖;SCs与VECs的比例为2∶1时,VECs促进SCs分化增殖的能力最强。4 SCs与VECs共培养可以作为促进组织工程人工神经血管化的方法之一,为最终实现组织工程人工神经移植的临床应用提供了可行的基础研究。