论文部分内容阅读
来源于构巢曲霉组成的乙醇诱导系统由两部分组成，分别为AlcR蛋白和一个诱导型启动子，乙醇存在条件下，可改变AlcR蛋白构象，使得原本没有活性的蛋白激活，激活后蛋白会识别诱导型启动子，如alcA启动子上AlcR特异性识别位点，激活启动子进一步使得目的基因表达。乙醇诱导系统可在时间和空间上控制目的基因的表达，利用乙醇诱导系统AlcR/alcA进行标记基因的删除验证试验中发现，未诱导条件下乙醇诱导系统AlcR/alcA在原核生物中为组成型表达。 为了研发新型乙醇诱导系统，使其在原核生物及真核生物中均为诱导型表达。对同alcA一样受到AlcR调控的启动子进行研究。实验中以构巢曲霉基因组为模板，克隆了alcS、alcM、alcP、alcU、alcR、alcA、aldA自然启动子并测序正确，构建载体pUC19-alcX(aldA)-Cre，利用Cre蛋白可识别两个同向loxp位点并发生删除或重组的Cre/loxp位点特异性重组系统，在原核生物大肠杆菌E.coli中验证在未诱导条件下，自然启动子的启动Cre蛋白表达而删除或重组两个同向loxp位点之间抗性基因情况。具体实验结果为: (1)自然启动子alcS在原核生物中，未诱导条件下启动了Cre表达，并删除了pYBA100中两个同向loxp位点之间的抗性基因片段; (2)自然启动子alcA、alcU和alcR在原核生物中，未诱导条件下启动Cre表达，并且pYBA100中两个同向loxp位点之间抗性片段发生重组现象; (3)自然启动子alcP、alcS与aldA在原核生物中，未诱导条件下没有启动Cre表达，pYBA100中两个同向loxp位点之间的抗性基因没有发生删除及重组现象。 实验结果表明，在原核生物中未诱导条件下，自然启动子alcP、alcS与aldA没有启动Cre表达而发生删除或重组现象，为无泄漏启动子;自然启动子alcA、alcU、alcS和alcR启动了Cre表达而使得两个同向loxp位点之间片段发生删除或重组，为组成型表达启动子。 随着除草剂抗性的转基因作物大面积推广种植，抗草甘膦转基因作物作为其中一种得到了广泛关注，而获得草甘膦抗性基因的研究日益增多。在关于抗草甘膦的已注册专利的EPSP合成酶编码序列中发现，来源于农杆菌C58的EPSPS基因仅在原核生物中进行了抗性鉴定，未在植物中进行抗性验证。 本研究在以根癌农杆菌C58为模板扩增EPSPS测序正确并改造后，构建了双元表达载体，利用农杆菌介导方法转入拟南芥中。对筛选的转基因阳性苗进行草甘膦浓度抗性测定，实验结果为:在转基因叶片涂施草甘膦浓度为0.02％条件下，转基因阳性苗变黄枯萎，表现抗性低。在此基础上对近年国内获得关于抗草甘膦的基因15项专利进行总结，并对抗草甘膦基因的氨基酸序列建立了系统发育进化树进行分析。所得结果为: (1)来源于农杆菌C58的EPSPS抗性基因在植物中对草甘膦耐性极低，无实际应用价值; (2)利用这些基因的蛋白序列与已知的一些EPSPS蛋白序列建立进化树分析，发现可以按是否含保守序列LGNAGTA将其分为两类; (3)Ⅰ型中（除专利9[87]外）含LGNAGTA保守序列，Ⅱ型中则不含有; (4)源于植物的EPSPS都属于Ⅰ型。 新型乙醇诱导系统可用于外源基因的表达，并可在时间和空间上进行调控目的基因的表达。不同来源的EPSPS抗草甘膦基因也可由乙醇诱导系统进行调控表达。将诱导系统与抗性基因构建载体并转入植物中，则可以实现抗性基因表达的可控。