随着肿瘤生物学的发展，肿瘤的生物治疗已逐渐成为治疗恶性肿瘤的第四模式，肿瘤的生物治疗在肿瘤综合治疗中发挥越来越大的作用。干扰素(IFN)作为主要的肿瘤生物治疗制剂之一，以其抑制肿瘤相关病毒的繁殖、抑制肿瘤细胞增生和诱导分化、促进凋亡，免疫调节及抑制肿瘤血管生成等功能，已被广泛应用于治疗14种以上的恶性肿瘤。但干扰素在鼻咽癌的治疗作用了解不多。本研究通过体内外实验，探讨干扰素对EB病毒阳性鼻咽癌细胞生长、转移的作用。 目前临床使用干扰素为蛋白制剂，蛋白形式的干扰素在体内半衰期短，需长期给药，使用药量大且血药浓度并不稳定，易出现全身各系统的毒副作用，目前认为干扰素抗肿瘤作用效果有限，这可能与干扰素在体内很难达到有效治疗剂量有关等。针对干扰素治疗肿瘤策略上存在的问题，本实验以重组腺相关病毒(rAAV)作为转基因载体，介导干扰素基因的表达，使机体细胞长期稳定表达基因，产生有生物活性的干扰素蛋白，同时以临床常规外源性干扰素治疗方法为对照，探讨干扰素在鼻咽癌的治疗作用及作用机制，为鼻咽癌生物治疗提供有价值的理论依据。 一、重组腺相关病毒(rAAV)载体的包装与鉴定采用分子克隆的方法 将IFN-α表达序列插入pAAV质粒的BamHⅠ及EcoRI酶切位点之间，将EGFP表达序列插入pAAV质粒的XhoⅠ及EcoRI酶切位点之间分别成功构建pAAV-IFN-α及pAAV-EGFP；采用无辅助病毒的双质粒共转染方法，pAAV-IFN-α(或pAAV-EGFP)及rAAV包装辅助质粒pDG共同转染HEK-293FT细胞，包装病毒；采用氯仿处理-PEG/NaCL沉淀-氯仿抽提3个步骤分离、浓缩和纯化重组腺相关病毒(rAAV)。 通过Real-Time PCR定量检测，确定包装病毒滴度均介于10<11>v.g./ml～10<12>v.g./ml之间。通过不同滴度rAAV-EGFP转染C666-1细胞，其结果显示48小时以5x10<4>v.g./细胞转染效率最高，达95％以上，纯化后的rAAV仍保持较强的感染性。RT-PCR及Western结果显示IFN-α在转录及翻译水平表达，表明rAAV-IFN-α载体的高效性。 二、rAAV-IFN-α对EBV(+)鼻咽癌细胞株的作用研究 IFN-α蛋白抑制EBV(+)鼻咽癌细胞株C666-1细胞生长的半数抑制剂量(IC50)实验；rAAV-IFN-α转染C666-1细胞的细胞增殖实验(MTT)；rAAV-IFN-α转染C666-1细胞流式细胞检测；细胞凋亡检测；RT-PCR鉴定rAAV-IFN-α转染C666-1细胞后IFN-α表达及转移相关基因表达变化；高效液相芯片技术(Liquichip)检测rAAV-IFN-α转染C666-1细胞后细胞上清中人IFN-α的含量。数据采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理。 结果显示：采用MTT试验，当IFN-α蛋白浓度达到1×10<5>IU/ml，C666-1细胞增殖明显受抑制(达50％)，即IC50；MTT试验显示，rAAV-IFN-α转染C666-1细胞培养48小时至72小时后，细胞平均吸光度与对照组比较无统计学差异(F=1.181，p=0.334)。流式细胞术结果显示，与对照组比较，rAAV-IFN-α转染48小时后能改变C666-1细胞周期，使G1期细胞比例增加(F=39.675，P=0.000)，效果优于IFN-α蛋白，但无统计学差异(P=0.059)。运用三种细胞凋亡检测方法结果显示，体外IC50浓度的IFN-α及rAAV-IFN-α均不能引起C666-1细胞明显凋亡。RT-PCR显示rAAV介导IFN-α表达后显著抑制C666-1细胞中EB病毒LMP-1及EBNA-1的表达，并下调肿瘤细胞MMP-9及VEGF的表达，IC50浓度的IFN-α亦能引起相同效应，但效果较弱。高效液相芯片技术(Liquichip)检测结果显示rAAV-IFN-α转染C666-1细胞后培养上清中IFN-α的含量随培养时间延长而增加，但培养至72小时总体浓度仍低于20U/ml。 三、rAAV介导IFN-α基因对EBV(+)鼻咽癌肝移植瘤生长和转移的实验研究 BALB/c-nu/nu雄性裸鼠64只建立EBV(+)鼻咽癌肝移植瘤动物模型。将64只裸鼠随机分成4组，即A组rAAV-IFN-α组、B组IFN-α组、C组rAAV-EGFP组及D组PBS组，每组16只；其中每组随机取8只用于观察抗肿瘤效果，其余8只用于生存期观察。观察rAAV-IFN-α、IFN-α对裸鼠鼻咽癌肝移植瘤生长和转移抑制的效应。免疫组化检测移植瘤组织中MMP-9的表达和微血管密度(MVD)。原位末端标记(TUNEL法)检测肝脏移植瘤肿瘤细胞凋亡。RT-PCR分析肿瘤组织IFN-α表达及转移相关基因表达变化。高效液相芯片技术检测血清中人IFN-α及鼠IL-12、GM-CSF、IFN-r、IL-2、IL-10、TNF-α的含量。确定不同组动物的生存期。数据采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理。 结果显示：肝脏鼻咽癌移植瘤3周后，A、B、C、D组肿瘤平均体积分别为(239.00±44.80)mm<3>、(340.25±75.96)mm<3>、(424.75±67.22)mm<3>、(430.75±112.05)mm<3>，四组肿瘤体积经方差分析提示有非常显著意义(F=10.397，P=0.000)，经多重比较rAAV-IFN-α与其他三组差异均有显著意义(P=0．000)，IFN-α组与EGFP及PBS组比较均有显著差异(P=0.029)，而EGFP组与PBS组比较差异无显著意义(P=0.880)。A、B、C、D组肝内转移分别为12.5％、37.5％、100％、100％；肺转移为0.0％、50.0％、87.5％、100％；平均生存期分别为(18.25±2.49)天、(15.13±1.13)天、(12.88±1.25)天、(12.63±1.19)天，4组之间有显著统计学差异(F=20.848，P<0.001)，其中rAAV-IFN-α生存时间较IFN-α组(P=0.001)及对照组(P=0.000)显著延长，IFN-α组较EGFP组与PBS组亦显著延长(P<0.01)。凋亡平均指数分别为(12.20±1.92)、(8.80±1.64)、(4.00±1.58)、(3.40±1.14)，经单因素方差分析差异有非常显著意义(F=34.11 8，P=0.000)，多重比较提示A组较其他三组均有显著差异，IFN-α较rAAV-EGFP及PBS组亦有显著差异(P=0.000)，而rAAV-EGFP与PBS组间无统计差异(P=0.561)。rAAV-IFN-α及IFN-α组移植鼻咽癌肿瘤组织MMP-9表达较rAAV-EGFP及PBS组显著下降，经秩和检验差异有显著差异(P=O.000)。rAAV-IFN-α及IFN-α组肝脏移植鼻咽癌肿瘤组织MVD(1.604±1.14)、(1.80±0.84)较对照组(13.00±2.74)、(13.20±2.59)，明显下降，经单因素方差分析差异有非常显著意义(F=53.498，P=0.000)。RT-PCR结果显示rAAV-IFN-α组肝脏移植鼻咽癌细胞内有IFN-amRNA表达，在IFN-α组及对照组无IFN.amRNA表达。在rAAV-IFN-α组及IFN-α组鼻咽癌细胞MMP-9mRNA、VEGFmRNA表达与对照组比较表达下降。用rAAV-IFN-α及IFN-α治疗荷瘤裸鼠后3周，A、B、C、D组裸鼠血清中IFN-α含量(U/ml，x ±s)分别为(7.01±2.68)(5.59±1.42)(1.81±0.48)、(1.30±0.34)，rAAV-IFN-α组血清中IFN-α的含量较IFN-α组含量高，但无统计学差异(P=0.126)，但较对照组显著升高(P=0.000)；检测四组裸鼠血清中IL-12含量分别为(pg/ml，x ±s)(105.02±43.43)(56.99±13.93)(0.00±0.00)(0.00±0.00)，rAAV-IFN-α组较IFN-α组(P=0.002)及对照组比较均有显著统计学差异；四组裸鼠血清中GM-CSF含量(pg/ml，x±s)分别为(105.23±21.05)、(100.52±14.59)、(72.42±22.76)、(63.08±26.100)，rAAV-IFN-α组比较IFN-α组无统计学差异(p=0.687)，较对照组有显著增长(P<0.01)。IFN-r、IL-2、IL-10、TNF-α四种细胞因子含量治疗组与对照组之间无统计学差异。 结论： 1、本研究采用的rAAV-IFN-α治疗策略能有效抑制鼻咽癌的生长和转移；从抑制移植瘤生长、转移抑制效果和生存时间比较，rAAV-IFN-α基因治疗优于外源性IFN-α蛋白治疗。 2、IFN-α主要通过抑制肿瘤血管增生，免疫调节作用发挥其抗EBV(+)鼻咽癌生长和转移作用，IFN-α对EBV(+)鼻咽癌细胞的直接抑制作用有限。 3、IFN-α可能通过抑制EBVLMP-1及EBNA-1基因表达发挥其抗EBV(+)鼻咽癌生长和转移作用。