背景与目的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症（Gluocose-6-phosphate dehydrogenasedeficiency，简称G6PD缺乏症）[MIM305900]是世界上最常见的单基因遗传病之一，也是我国南方地区人群中常见的血液遗传病之一，世界范围内约有4亿人受累。G6PD缺乏症属X连锁不完全显性遗传，男性半合子G6PD活性呈显著性缺乏，女性杂合子酶活性变化范围较大，可呈显著性降低，也可在正常范围。G6PD基因定位于Xq28，全长约20kb，含13个外显子和12个内含子，编码515个氨基酸。G6PD缺乏症的分子基础多表现为单个碱基置换的错义突变，导致氨基酸置换，使G6PD活性降低，还未发现大片段缺失、无义突变和移码突变。目前全世界已报道了150多种G6PD基因突变型，突变的分布具有种族和地区异质性。迄今为止在东南亚人群中发现30种G6PD基因突变型，在我国人群中发现的突变有24种，其中1388G＞A、1376G＞T、95A＞G是最常见的突变，约占总突变的70％以上。由于方法学的限制，我国以往对该病的研究主要是采取基于男性患者的调查策略（the male patient-based investigation），即以表型阳性的男性样本鉴定G6PD缺乏症的发生率及其基因突变谱，几乎未涉及该病的基因型和表型关系分析。广西是一个有着4.9千万人口的少数民族地区，该地区G6PD缺乏症的流行病学资料尚不清楚，特别是女性携带者和病人的资料几乎不了解。本研究采用基于人群的分子分析策略（the population-based molecularanalysis），完成了对该地区人群的G6PD缺乏症发生率、突变谱、表型与基因型关系和单倍型的分析，以及女性的系统分子鉴定。设计与方法用于本研究的样本共4，704例（其中男性2，368例，平均年龄29.45±5.06岁；女性2，336例，平均年龄26.52±3.89岁），于2002年10月至2003年10月期间于柳州市妇幼保健院婚检门诊采集，被检者就诊时均无贫血表现。这些样品98.5％是来自于中国南方地区，其中94.8％的样本的祖籍地来自广西壮族自治区14个不同地区，无血缘关系。随机选取的样本中汉族和壮族人群的比例与广西全区二者的比重相同，分别占64.3％（3，027／4，704，汉族）和32.5％（1，528／4，704，壮族），其余149例样品来自其他少数民族。正常对照129例，其中男性64例，年龄：23～42，平均年龄29.91±3.29，G6PD／6PGD比值为：1.62～1.79（1.73±0.11）；女性65例，年龄：23～34，平均年龄27.48±2.56，G6PD／6PGD比值为：1.58～1.93（1.65±0.09）。本研究提出并建立了表型筛查与基因型分析结合的系统分子鉴定流程：采用传统的高铁血红蛋白还原试验（methemoglobin reduction test，MetRT，检测标准为：MetHb％＞75％为阴性；MetHb％≤75％，为阳性）进行初筛，然后用WHO推荐的G6PD／6PGD比值法（诊断标准为：比值＞1.5为阴性；比值≤1.5为阳性）进行检测，接着我们把所有经过检测高铁血红蛋白还原试验为阳性的样品（或者说经过G6PD／6PGD比值法确诊为表型阳性的样品和所有疑似样品）用标准方法抽提基因组DNA，通过引物延伸／变性高效液相色谱（primer extension／Denaturing High Performance Liquid Chromatographty，PE／DHPLC）技术进行基因型分析，该技术能同时检测10种东南亚地区常见G6PD基因突变型（95 A＞G 392 G＞T，487 G＞A，493 A＞G，592 C＞T，871 G＞A，1024C＞T，1360 C＜T，1376 G＞T和1388 G＞A）和一种多态性位点（1311 C＞T），最后，为了检测是否存在新突变或其他突变类型，我们对PE／DHPLC技术未检测出的阴性样本进行G6PD基因12个外显子和外显子-内含子结合区的直接测序。此外，我们从高铁血红蛋白还原试验检测为阴性的4，263例样品中随机选取129例样品作为正常对照组，用PE／DHPLC技术检测其G6PD基因突变的情况，在65例女性样品中发现两例常见突变类型（1376 G＞T和1388 G＞A），为了验证这部分女性样品是否还存在其他G6PD基因突变类型，我们同时对其进行DNA测序。本研究诊断G6PD缺乏症的标准主要包括：（1）高铁血红蛋白还原试验（MetRT）和G6PD／6PGD比值法检测为表型阳性；或者（2）用PE／DHPLC技术或DNA测序进行分子学分析检测出阳性突变。结果与讨论本研究共检测出G6PD缺乏症阳性样品361例，其中男性个体176例，因此广西壮族自治区G6PD缺乏症基因频率为7.43％；女性个体185例，该地区汉族人群的突变基因频率（16.38％，249／1，520）与壮族人群（15.39％，117／760）比较无统计学差异（X²=2.368，P＞0.05）。我们从上述361例样品中鉴定出320例个体有阳性基因突变，共27种不同基因型，包括8种半合子、13种杂合子和6种纯合子，此外，还有41例（15例男性和26例女性）表型阳性的样品未发现任何突变。我们对G6PD基因突变谱鉴定结果显示，1388G＞A（G6PD Kaiping），1376G＞T （G6PD Canton），95A＞G （G6PD Gaohe），1024C＞T （Chinese-5）和871G＞A （G6PD Viangchan）等5种突变为该地区人群的常见突变，占G6PD缺陷等位基因的85％，另外检测到10种（392G＞T，442G＞A，1004C＞T，202G＞A，592C＞T，519C＞T，196T＞A，703C＞T，202G＞A／871G＞A和1414A＞C）少见突变，约占突变染色体的4％。在这些变异中，有6种为中国人首次报道的突变，其中4种为我们研究发现的新突变，它们是442G＞A （G6PD Liuzhou），703C＞T（G6PD Nanning），1414A＞C （G6PD Laibin），202G＞A／871G＞A（G6PD Hechi）；另二种稀有突变，196T＞A和202G＞A曾分别在泰国和日本人中报告过。此外，我们根据G6PD／6PGD比值表型指标的变化，将女性三种常见突变（分别为1376G＞T，1388G＞A，95A＞G）杂合子的相同基因型样品进一步分为阳性组（G6PD／6PGD≤1.5）和阴性组（G6PD／6PGD＞1.5），两两比较这3种相同基因型各自配对的阳性组与阴性组之间的表型差异，结果显示MetHb％和G6PD／6PGD比值在三配对资料二组之间均有显著差异(P=0.000，P＜0.05，本研究提示，即使是在相同突变时，女性杂合子的G6PD酶活性存在很大的变异性，由于G6PD缺乏症的遗传方式呈X连锁不完全显性遗传，根据Lyon学说，女性的两个G6PD等位基因，有一个处于失活状态，即随着酶缺乏的红细胞与正常的红细胞嵌合的差异，女性杂合子具有不同的表现度，这与该病不完全显性的遗传方式相吻合。分组比较的统计学分析结果显示，表型指标高铁血红蛋白还原率（MetHb％）和G6PD／6PGD比值在女性杂合子组（MetHb％：43.22±17.42；G6PD／6PGD：1.33±0.40；n=164）和男性半合子（MetHb％：29.63±15.12；G6PD／6PGD：0.50±0.31；n=176）有显著差异(P=0.000，P＜0.05；女性杂合子组（同上）和纯合子组（MetHb％：33.16±6.34；G6PD／6PGD：0.57±0.24；n=21）有显著差异(P=0.000，P＜0.05；而男性半合子组和女性纯合子组之间无统计学差异（MetHb％：P=0.272，P＞0.05；G6PD／6PGD：P=0.310，P＞0.05）；正常对照组（正常参考值为MetHb％：88.10±5.23；G6PD／6PGD：1.70±0.11；n=129，男性64例，女性65例，无性别差异，P=0.121，P＞0.05）与上述杂合子、纯合子和半合子各组间均有差异(P=0.000，P＜0.05。同时从129例表型“正常”样品中经过测序检测出3例突变（1376G＞T，1388G＞A和1414A＞C），这提示了包括常见变异在内的许多隐性突变体很可能隐藏在“正常“杂合子个体中，而被一般表型筛查所漏检，只有采用直接分子筛查才可以鉴定这类突变。我们对176例男性G6PD缺陷染色体和6例女性新突变染色体的单倍型进行了202A（NlaⅢ），376G（FokⅠ），1116G（Pst），1311T（BclⅠ），内含子11-93C（NlaⅢ）等5个多态性位点的分析，结果表明182个缺陷染色体中的94％为单倍型（--+--），提示常见的nt95A＞G，1024C＞T，1376G＞T和1388G＞A等4个位点的突变应源于这一古老的常见单倍型，此外，还存在三种不同的单倍型：8例G6PD Viangchan突变、1例G6PD Canton突变和6例未知突变为单倍型（--+++）；新突变G6PD Hechi^202A／871A为单倍型（+-+-+）和G6PD Asali为单倍型（+-+--）。我们发现这5个多态性位点之一的常见1311T在当地男性中的频率为7.8％，该多态性基因频率与1311T／内含子11-93C cis变异的频率相同，内含子11.93C产生的NlaⅢ限制性酶切位点与1311C＞T呈现紧密关联，可能导致G6PD hnRNA（heterogeneous nuclear RNA）在形成成熟的Mrna过程中，核内的snRNA与内含子11的结合引起构像改变，从而引起酶活性的缺乏；同时我们在广西地区检测到的11例871G＞A突变均合并1311多态性位点，形成的单体型均属于G6PD Viangchan变异型，这与目前东南亚包括中国南方地区所有的报道相一致。综上所述，我们的流行病学调查不仅阐明了广西壮族自治区人群G6PD缺乏症的发生率、基因突变谱、单倍型和一组基因型和表性关系的分析结果，而且详细地描述了女性携带者和病人的情况，这为制订该地区G6PD缺乏症的预防计划提供有价值的参考，同时对于阐明G6PD基因分布和遗传规律，揭示地区人群起源和迁徙有重要作用。G6PD缺乏症的快速诊断除了能提供遗传咨询信息，预防溶血性贫血、新生儿高胆红素血症和孕妇流产外，还为临床鉴别诊断和病因研究提供有利的支持。本研究所采用的表型筛查与基因型分析结合的系统分子鉴定流程，除了可应用于广西地区对G6PD缺乏症进行调查外，还可以用于世界上G6PD缺乏症高发的不同地区进行该病的调查，对扩展G6PD基因缺陷的相关知识提供重要的依据。