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目的：
(1)观察线粒体(mitochondria)在前列腺素E2受体亚型3(EP3)选择性激动剂ONO-AE-248诱导的中性粒细胞(polymorpho-nuclear neutrophils，PMN)非凋亡性程序化死亡(non-apoptotic progra-mmed cell death，non-apoptotic PCD)中的形态结构及跨膜势能(mitochondria transmembrane potentials，△ψmt)的改变。
(2)前期研究利用双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)和蛋白质质谱分析(matrix-assisted laser desorption/ionization time of misht mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技术发现，在PMN自发性凋亡和ONO-AE-248所诱发的非凋亡性程序化死亡中有差异表达的蛋白质存在，其中最为显著的差异表达蛋白可能是凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)。
本研究在前期研究的基础上，进一步设计编码ASC蛋白的基因TMS1的特异性引物，利用逆转录聚合酶联反应(reversetranscriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测ASC在空白、LPS、TNF-a及ONO-AE-248刺激下的表达情况，探索PMN的这种新型细胞死亡形式的发生机制，进而为在白细胞生物学界最终确立一种新型的PMN死亡形式-PMN非凋亡性程序化死亡奠定基础。
方法：Ficoll法新鲜分离、纯化健康志愿者外周血PMN，利用台盼蓝拒染试验、怀特-姬姆萨染色法鉴定细胞活力与纯度(二者均应大于96％方可用于后续试验)。用RPMI-1640(含100 mL/L FCS)将分离纯化的中性粒细胞制备成细胞悬液，调整细胞密度为2×106个/mL，以每孔1 mL将细胞置于24孔板中。构建四种PMN死亡模型(自发性凋亡组、LPS诱导的凋亡延迟组、TNF-a诱导的凋亡促进组和ONO-AE-248诱发的非凋亡性程序化死亡组)，在37℃(含5％CO2，湿度90％)的恒温孵箱中培养到预定时间后，经20g/L戊二醛10g/L的锇酸固定、丙酮梯度脱水、环氧树脂包埋聚合、超薄切片和醋酸铀染色后，运用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察2h、6h的PMN内线粒体形态结构的变化；利用Mitocapture染液结合线粒体后随膜势能的改变激发出不同荧光的特点，用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测不同细胞死亡模型中3h、6h、9h和18 h线粒体跨膜势能的改变；Trizol法提取PMN内总RNA，运用紫外分光光度法和RNA琼脂糖电泳法鉴定其纯度和含量(OD260/OD280之比值应在1.8～2.0。琼脂糖电泳出现明显的28s，18s和5s三条条带，且28s条带亮度约为18的2倍)。按照标准操作程序的要求将20μL体系中的mRNA逆转录成cDNA，按PCR试剂盒和引物退火温度的要求在50μL体系进行聚合酶联反应，然后用1.5％进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析ASC在四种不同死亡模型中表达的情况。
结果：
(1)ONO-AE-248刺激6h后PMN线粒体多肿胀显著，体积增大，基质变淡，嵴紊乱，嵴断裂，甚至空泡变，明显不同于自发性凋亡组；
(2)在PMN体外培养早期3h、6h和9h，ONO-AE-248即能迅速导致PMN线粒体膜势能的溃散，其强度远大于自发性凋亡组(P<0.05)，18h后线粒体膜势能降至低值；
(3)通过RT-PCR检测四种PMN细胞死亡模型发现，ASC mRNA在自发性凋亡组、凋亡促进组和凋亡延迟组均有较强的表达，但在ONO-AE-248刺激组表达却很弱(P<0.01)。
结论：
(1)线粒体形态结构的剧烈变化是ONO-AE-248诱导的PMN非凋亡性程序化死亡区别于凋亡的早期形态学特征事件之一，早期线粒体外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)剧变并导致PMN迅速突破线粒体膜势能屏障可能是ONO-AE-248发挥强大的致非凋亡性程序化细胞死亡效应的分子机制之一。
(2)ONO-AE-248诱发的PMN非凋亡性程序化死亡组与PMN自发性凋亡组相比较凋亡相关的斑点样蛋白 ASC 的表达存在明显的差异，ASC在ONO-AE-248所诱导的PMN非凋亡性程序化死亡组中的表达量极低，而在自发性凋亡组、LPS诱导的PMN凋亡延迟组和TNF-a诱导的凋亡促进组中的表达较高。表明：ASC在PMN凋亡的进程中可能发挥强大的正调控作用，即当PMN高表达ASC时，促使细胞内生化信号循传统凋亡的途径发展；而当ONO-AE-248抑制ASC表达时，可能就关闭了传统凋亡的信号途径，但同时也解除了对非凋亡性细胞程序化死亡信号途径的阻遏，从而激活相关的致死信号蛋白，使PMN循另一条途径发生快速主动性死亡—非凋亡性程序化细胞死亡。