人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)是源自胚胎内细胞团的一种可以维持在体外稳定自我更新并保留多向分化潜能的人多能干细胞(human pluripotent stem cells，hPSCs)。理论上，通过在体外模拟细胞的发育历程，我们可以定向诱导hESCs分化为人体三个胚层中的任意一种类型的细胞。正因为如此，定向诱导hESCs获得特定目的细胞在疾病细胞治疗、药物筛选以及发育生物学研究上都有着非常广泛的应用前景。在胚胎的发育过程中，pMN区(motoneuron progenitor domain)是脊髓腹侧的一个特定区域。该区域内的细胞特异性表达转录因子OLIG2(oligodendrocyte transcription factor2)。在人体的发育的过程中，该区域的OLIG2+神经祖细胞首先分化产生负责控制机体骨骼肌运动的脊髓运动神经元。之后，OLIG2+神经祖细胞又会分化为脊髓大部分的少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)，而这些OPCs会在随后的发育过程中分化成熟为负责脊髓中髓鞘形成的少突胶质细胞。不论是脊髓运动神经元还是少突胶质细胞出现异常，都会导致复杂疾病的发生，严重降低患者生活质量甚至导致患者死亡。而目前针对以上复杂的疾病临床上尚无特效的治疗办法。随着对多能干细胞研究的开展，在脊髓损伤动物模型中移植hPSCs来源的脊髓神经干细胞和在脱髓鞘疾病动物模型中移植hPSCs来源的OPCs均能够有效缓解实验动物的临床症状，改善其多项生理功能，显示了hPSCs巨大的临床转化潜力。而在基础研究中，人们对于调控OLIG2+神经祖细胞在后续发育过程中命运决定的具体调控机制尚不十分清楚，仍需要可稳定自我更新的OLIG2+神经祖细胞作为模型以解决这一基础的生物学问题。而通过hESCs获得可在体外稳定自我更新的脊髓pMN区的OLIG2+神经祖细胞一方面可以在短时间内分化为可供细胞治疗使用的目的细胞以推动临床转化应用，另一方面由于该细胞兼备神经元及少突胶质细胞的分化潜能，也可以作为研究细胞命运决定调控机制的细胞模型以解决尚不明确的生物学问题。因此，获得hPSCs来源的可于体外稳定自我更新的脊髓pMN区OLIG2+神经祖细胞不论是对于临床转化应用还是基础研究都有重要的意义。
　　在本研究中，我们遵循体内的发育线索，结合其他科研人员和我们前期的研究成果，通过叠加化学筛选方法建立了一种成分明确的诱导培养体系。在单层贴壁培养的条件下，首先在经典的双重SMAD抑制方法的基础上利用化合物激活Wnt信号通路，可以在1周的时间里诱导H1和HUES9人胚胎干细胞系快速高效地分化为表达HOXB8(Homeobox B8)、HOXB9(Homeobox B9)、SOX2(SYR-box transcription factor2)和NESTIN的脊髓神经祖细胞(spinal cord neuroepithelial progenitors，spNEPs);在此基础上，利用音猬因子(Sonic Hedgehog，SHH)和Smoothened激动剂SAG来激活SHH信号通路的同时以化合物K02288来抑制BMP(bone morphogenetic protein)信号通路对该spNEPs进行腹侧化诱导，在10天左右的时间里即可以获得较高纯度的脊髓pMN区的OLIG2+神经祖细胞，并且该神经祖细胞在体外可以维持一段时间的扩增。但是，我们在长期传代培养的过程中发现利用该方法扩增的神经祖细胞会自发地分化出不再表达OLIG2的星形胶质细胞谱系的祖细胞，而导致这一现象发生的原因可能与细胞所受张力变化及Hippo/YAP信号通路相关。鉴于此，我们利用前期研究中筛选得到的对YAP(YES-associated protein)活性有抑制作用且能够降低细胞所受张力的化合物B对该腹侧化及长期扩增的培养方法进行针对性的优化，成功维持了细胞OLIG2的均一表达。通过对这一腹侧化诱导及扩增方法的改良，新的培养条件能够维持OLIG2+神经祖细胞在体外稳定自我更新超过20代。而且该OLIG2+神经祖细胞在体外长期稳定自我更新的过程中始终保持脊髓pMN区神经祖细胞的分化特征，能够快速分化为表达HB9(motor neuron and pancreas homeobox l，MNX1)、ISL1(ISL LIM homeobox1)、ChAT(choline acetyltransferase)和vAChT(vascular acetylcholine transporter)的成熟脊髓运动神经元，该成熟神经元还能够同骨骼肌形成神经肌肉接头，控制肌肉收缩。除了能够分化成熟为脊髓运动神经元之外，该OLIG2+神经祖细胞还保留着向少突胶质细胞谱系分化的潜能。经过诱导培养后，我们能够抑制该OLIG2+神经祖细胞向神经元方向的分化能力，而使其定向分化为表达SOX10(SYRbox transcription factor10)和PDGFRα(platelet derived growth factor receptor alpha)的OPCs，而且获得的OPCs可以进一步分化成熟为表达MBP(myelin basic protein)和O4的少突胶质细胞。在定向诱导该OLIG2+神经祖细胞向脊髓运动神经元方向分化时，我们发现对GSK3(glycogen synthesis kinase-3)的抑制十分关键。通过使用高浓度的CHIR99021抑制GSK3可以使OLIG2+神经祖细胞表达NGN2(neurogenin-2，NEUROG2)从而启动脊髓运动神经元的成熟分化进程。
　　如何获得可在体外稳定自我更新的OLIG2+神经祖细胞是本领域尚未解决的难题。由于无法维持该神经祖细胞在体外的稳定自我更新，使得每次诱导分化获得脊髓运动神经元或少突胶质细胞均需要从多能干细胞阶段起始，浪费了大量时间和资源。而且分化成熟的运动神经元由于其迁移能力减弱和增殖能力丧失等原因并不完全适合应用于细胞移植治疗。以上几个方面都给干细胞的临床转化应用带来了阻碍。我们在本研究中构建了一个成分明确的诱导培养体系。该培养体系能够在单层贴壁培养的条件下快速且高效地定向诱导H1和HUES9细胞分化为脊髓pMN区的OLIG2+神经祖细胞，并且首次实现了该神经祖细胞在体外的稳定自我更新。同时，该神经祖细胞在体外自我更新的过程中始终保持着向脊髓运动神经元方向和少突胶质细胞方向的分化潜能。通过定向诱导分化能够使该神经祖细胞在较短的时间内分化为成熟的脊髓运动神经元和少突胶质细胞。该培养体系的成功构建以及获得了可于体外稳定自我更新的OLIG2+神经祖细胞初步为前文提到的影响临床转化应用的难题提供了一种解决方案。因此，该细胞有望在细胞治疗、疾病模拟和药物筛选等领域中发挥一定的作用。另外，该稳定自我更新的OLIG2+神经祖细胞也可以作为研究脊髓pMN区祖细胞命运选择机制的细胞模型。