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实验目的本课题旨在研究阿可拉定、或阿可拉定与抗肿瘤药物联合运用的抗肿瘤作用效果及作用机制。实验方法1.细胞水平探讨阿可拉定抗肿瘤作用效果：选择四种不同浓度(1μmol/L.5μmol/L、10μmol/L.20μmol/L)的阿可拉定,采用MTT实验方法,对子宫内膜癌细胞株Ishikawa, Hec-1b以及子宫颈癌细胞株Siha, Hela四株肿瘤细胞系进行24h,48h,72h阿可拉定药物处理,检测该四株细胞系在不同药物浓度、不同作用时间对肿瘤细胞增殖的抑制效果。2.分子水平探讨阿可拉定、阿可拉定联合抗瘤药物的抗肿瘤作用：采用RT-PCR方法,对子宫内膜癌细胞Ishikawa, Hec-1b以及子宫颈癌细胞Siha, Hela四株细胞系进行不同药物处理：阿可拉定、顺铂、他莫西芬、阿可拉定联合顺铂、阿可拉定联合他莫西芬、空白对照组,培养48小时后提取各处理组RNA,逆转录成cDNA后进行PCR实验,检测雌激素受体ER-a36, ER-a66,细胞凋亡基因Bax、抑癌基因P27以及细胞周期相关基因Cyclin D1的表达情况。3.动物水平探讨阿可拉定、阿可拉定联合抗瘤药物的抗肿瘤作用效果以及改善荷瘤小鼠免疫功能的作用：建立荷瘤小鼠实体瘤模型,模型建立成功后,分六组：阿可拉定高剂量组、低剂量组、环磷酰胺单独用药组、阿可拉定联合环磷酰胺、模型组、空白对照组,进行上述药物的抗肿瘤实验研究。给药期间每天对小鼠进行称重,观察体重变化,连续给药15天后,解剖小鼠,保留实体瘤、脾脏、胸腺并进行称重,计算各相关指数；小鼠尾尖取血检测生化指标。实验结果1.阿可拉定对子宫内膜癌细胞具有较明显的抗肿瘤作用,对子宫颈癌细胞株具有一定的抗肿瘤作用。1.1阿可拉定对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖作用的影响：MTT实验结果显示,以阿可拉定处理Ishikawa细胞24h后,细胞出现形态学的改变,48、72h后出现胞质浓集、细胞膜破裂现象。其抑制作用随药物浓度和给药时间的增加逐渐增强,在浓度大于5μmol/L时其抑制作用随药物浓度和给药时间的增加逐渐增强。根据各组抑制率及药物浓度的对数,采用回归方程计算出72h阿可拉定的IC50值为11.5μmol/L.1.2阿可拉定对子宫内膜癌Hec-1b细胞增殖作用的影响：MTT实验结果显示,以阿可拉定处理Hec-1b细胞24h后,细胞出现形态学的改变,48、72h后出现胞质浓集、细胞膜破裂现象。其抑制作用随药物浓度和给药时间的增加逐渐增强。根据各组抑制率及药物浓度的对数,采用回归方程计算出72h阿可拉定的IC50值为5.26μmol/L。1.3阿可拉定对子宫颈癌Siha细胞增殖作用的影响：MTT实验结果显示,以阿可拉定处理Siha细胞24h后,细胞出现形态学的改变,48、72h后出现胞质浓集、细胞膜破裂现象。其抑制作用随药物浓度和给药时间的增加逐渐增强。给药24h,、48h、72h后最高抑制率到达40%左右,表示阿可拉定对该细胞的细胞增殖具有一定的抑制作用。1.4阿可拉定对子宫颈癌Hela细胞增殖作用的影响：MTT实验结果显示,以阿可拉定处理Hela细胞24h后,细胞出现形态学的改变,48、72h后出现胞质浓集、细胞膜破裂现象。其抑制作用随药物浓度和给药时间的增加逐渐增强,24h细胞增殖抑制率为30%,显示了阿可拉定对细胞生长抑制作用不明显。2.阿可拉定、阿可拉定联合抗瘤药物的抗肿瘤作用主要通过调节雌激素受体、细胞周期以及细胞凋亡相关因子在细胞内的表达实现的。2.1阿可拉定对Ishikawa细胞相关基因的调节作用：RT-PCR实验中结果显示,低浓度阿可拉定上调了雌激素受体ER-a36、 ER-a66的表达(P>0.05),显著降低了凋亡基因Bax的表达(P<0.05),由此推测低浓度下的阿可拉定降低了对细胞的抑制作用,其可能的作用机制是通过上调雌激素受体的表达,下调凋亡基因的表达来实现。与此同时,从研究结果中还观察到,低浓度的阿可拉定与常用的妇科抗肿瘤药物顺铂(DDP)、他莫西芬(TAM)联用,能明显降低雌激素受体ER-α36、 ER-α66的表达(P<0.05),显著上调凋亡基因Bax以及抑癌基因P27的表达(P<0.05)。此结果提示阿可拉定可能作为常用的妇科抗肿瘤药物的辅助药物发挥抗癌增效作用。2.2阿可拉定对Hec-1b细胞相关基因的调节作用：RT-PCR结果显示,阿可拉定明显下调了Hec-1b细胞雌激素受体ER-α36、 ER-α66的表达(P<0.05),明显上调了抑癌基因P27的表达(P<0.05),由此推测,阿可拉定对Hec-1b细胞的抑制作用可能是通过下调雌激素受体和上调抑癌基因实现的。与此同时,从研究结果中还观察到,阿可拉定与常用的妇科抗肿瘤药物顺铂(DDP)、他莫西芬(TAM)联用,能明显降低雌激素受体ER-α36、 ER-a66的表达(P<0.05)。此结果提示了阿可拉定可能作为雌激素依赖型妇科肿瘤的辅助治疗药物,发挥抗癌增效作用。2.3阿可拉定对Siha细胞相关基因的调节作用：RT-PCR结果显示,阿可拉定明显下调了Siha细胞的雌激素受体ER-α36、 ER-α66的表达(P<0.05),明显上调了凋亡基因Bax和抑癌基因P27的表达(P<0.05),轻度下调了细胞周期相关基因Cyclin D1的表达,这些作用有可能成为阿可拉定产生细胞增殖抑制作用的相关基因,但Siha细胞对阿可拉定的低敏感性作用机制尚未清楚,推测可能与其他肿瘤基因相关。2.4阿可拉定对Hela细胞相关基因的调节作用：RT-PCR结果显示,阿可拉定明显上调了雌激素受体ER-α36、 ER-α66的表达(P<0.05),同时明显上调了凋亡基因Bax和抑癌基因P27的表达(P<0.05),轻度下调了细胞周期相关基因Cyclin D1的表达,这些作用有可能成为阿可拉定产生细胞增殖抑制作用的相关基因,但Hela本实验未显示阿可拉定对该细胞明显抑制作用,其作用机制尚待进一步探讨。3.阿可拉定以及阿可拉定联合抗瘤药物对于H22肝癌、S180腹水瘤小鼠的肿瘤生长抑制作用不明显,但其具有一定的改善荷瘤小鼠免疫功能的作用。3.1阿可拉定以及阿可拉定联合抗瘤药物对H22肝癌小鼠肿瘤生长的抑制作用：实验结果显示,(1)各药物组处理后,小鼠的瘤重指数显示：与模型组比较,162高剂量、162低剂量、环磷酰胺组的瘤重指数显著提高(P<0.05),结论提示在本实验条件下,阿可拉定对该动物模型未显示其抑制肿瘤生长的作用。(2)各药物组处理后,作为免疫器官的脾脏和胸腺指数以及各项生化指标提示,阿可拉定、阿可拉定联合抗瘤药物具有一定的改善荷瘤小鼠免疫功能的作用。3.2阿可拉定以及阿可拉定联合抗瘤药物对S180腹水瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用：实验结果显示,(1)各药物组处理后,小鼠的瘤重指数显示：与模型组比较,除162联合环磷酰胺组、环磷酰胺单独用药组能明显降低瘤重指数外(P<0.05),162高剂量、162低剂量组瘤重指数并无降低作用(P>0.05),结论提示在本实验条件下,阿可拉定单独用药对动物体内抑制肿瘤生长的作用不明显,但与环磷酰胺联合使用时,其抗肿瘤作用较为显著。(2)各药物组处理后,作为免疫器官的脾脏和胸腺指数以及各项生化指标提示,阿可拉定、阿可拉定联合抗瘤药物具有一定的改善荷瘤小鼠免疫功能的作用。实验结论1.阿可拉定对体外培养的子宫内膜癌细胞具有良好的抗肿瘤作用效果。2.阿可拉定、阿可拉定联合抗瘤药物在分子水平上具有一定调节肿瘤相关基因表达的作用。3.阿可拉定、阿可拉定联合抗瘤药物在本实验条件下,对于本实验动物动模型未见明显的抗肿瘤作用；阿可拉定、阿可拉定联合抗瘤药物具有一定的改善荷瘤小鼠免疫功能的作用。