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背景和目的:B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin’s lymphoma,B-NHL)是一组起源于淋巴结和其他淋巴组织的恶性肿瘤。传统治疗B-NHL的方法主要包括化学疗法、放射疗法以及联合利妥昔单抗(Rituximab,美罗华)的多种联合化疗方案。虽然基于美罗华的抗体靶向治疗取得较高的完全缓解率,但在临床上仍有超过50%患者对美罗华产生耐药,导致复发或者转移。随着B细胞淋巴瘤表面抗原的发现以及分子生物学技术的不断发展,靶向治疗B-NHL的研究越来越受到关注。CD19分子因其表达于造血干细胞外的B淋巴细胞发育的各个阶段,被认为是B-NHL中CD20之外的另一个理想靶点。仅由抗体的轻链、重链可变区片段构成的微型双特异性抗体(bispecific antibodies,bsAbs)是继单克隆抗体之后的一种新型抗体药物。它通常具有两个不同的抗原结合位点,可选择性募集效应细胞至靶细胞周围,从而介导特异性杀伤作用。目前最为有前景的就是已被美国FDA批准用于治疗前B细胞急性淋巴细胞白血病的双特异性抗体blinatumomab。虽然blinatumomab在临床中取得了满意的疗效,但也有其局限性。因其分子量(55 kDa)低于肾小球过滤的阈值,blinatumomab在体内的半衰期较短,从而需要长时间的持续输注,为患者带来一定程度的不便以及潜在的治疗相关的副作用。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类存在于多种组织、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。由于MSCs可以特异地向肿瘤趋化,加上其免疫原性低及易于进行基因改造的特点,MSCs已成为基因治疗的理想载体。基于上述背景和理论,本研究探索一种双重靶向治疗系统,即利用MSCs向肿瘤部位归巢的能力,通过基因工程修饰MSCs使其在肿瘤局部表达并分泌能同时靶向结合CD3和CD19抗原的串联四价双特异性抗体(tetravalent bispecific tandem diabody,TandAb)Tandab(CD3/CD 19)。同时评价此靶向治疗系统联合使用IDO通路抑制剂1-甲基-D-色胺酸(D-1-methy1-tryptophan,D-1MT)后对肿瘤的抑制作用。方法:采用PCR、重叠PCR(overlap PCR)、酶切、连接等方法构建慢病毒表达载体 pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)、pLentiR.SV40-fLuc 和 pLentiR-EV(空载体对照),经测序验证其正确性。将慢病毒表达载体pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)瞬时转染至293T细胞,收集培养上清并通过His标签亲和层析对产物进行纯化,通过Western blot检测培养上清及纯化后样品中的目的蛋白Tandab(CD3/CD19)。利用流式细胞术(Flow cytometry analysis,FACS)检测 Tandab(CD3/CD19)与 CD19 阳性细胞和CD3阳性细胞的结合特异性,并通过乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase,LDH)释放法检测Tandab(CD3/CD19)介导的特异性杀伤活性。利用293T细胞包装慢病毒颗粒,并感染人脐带组织来源的MSCs,使其稳定表达Tandab(CD3/CD19)(MSC-Tandab)或者萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,fLuc)(MSC-Luc)。采用 MTT 法检测MSCs经慢病毒感染后增殖能力的变化,利用Western blot和ELISA分别检测Tandab(CD3/CD19)在MSCs细胞内的表达及分泌水平。体外利用Transwell迁移实验研究慢病毒感染对MSCs向Raji细胞趋化的影响。体内于BALB/c裸鼠上建立CD19阳性Raji淋巴瘤细胞皮下移植模型,利用生物发光成像系统观察MSC-Luc向肿瘤部位的归巢情况。通过建立共培养杀伤系统,利用FACS检测MSC分泌的Tandab(CD3/CD19)在体外介导的T细胞对CD19阳性的Raji淋巴瘤细胞的杀伤作用,同时通过FACS检测相互作用后T细胞活化表面标志CD69和CD25的变化,并采用ELISA试剂盒检测相互作用后培养上清中的细胞因子水平。此外,通过联合使用D-1MT后于不同时间点检测对靶细胞杀伤;同时采用比色法测定培养上清中色氨酸代谢产物犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)的变化以及通过实时定量PCR(real-timePCR)检测T细胞无能相关基因CD98和Jumonji的表达变化。在体内,对Raji淋巴瘤移植模型联合应用MSC-Tandab+PBMC和D-1MT进行治疗,每3天测量肿瘤直径和小鼠体重,治疗结束后取瘤组织进行称重,根据肿瘤重量计算抑瘤率,评价疗效。结果:成功构建慢病毒表达载体 pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)、pLentiR.SV40-fLuc及pLentiR-EV,并经测序证明了其基因正确性。质粒pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)瞬时转染293T后,Westernblot及FACS结果表明串联四价双特异性抗体成功表达于真核细胞且能特异性结合CD19阳性细胞(Raji、Daudi、BJAB)和CD3阳性细胞(Jurkat),而不与CD19阴性且CD3阴性的K562细胞结合。LDH释放实验结果表明293T表达的Tandab(CD3/CD19)能够特异性介导T细胞对CD19阳性细胞的杀伤。成功包装出慢病毒颗粒LentiR-Tandab(CD3/CD19)、LentiR-EV及LentiR-fLuc。MSCs经慢病毒LentiR-Tandab(CD3/CD19)感染后高效表达目的蛋白Tandab(CD3/CD19),且其增殖能力与体外迁移能力和感染前相比没有明显改变。成功建立了 Raji细胞皮下移植瘤模型,生物发光成像结果表明MSC-Luc经尾静脉注射后24 h选择性地归巢至肿瘤部位。体外共培养杀伤结果表明,相互作用24 h后MSC-Tandab分泌的Tandab(CD3/CD19)所介导的T细胞对Raji细胞的杀伤达到60.6 ± 5.7%,明显高于对照组(P<0.001)。同时T细胞表面活化标志CD69和CD25的表达及细胞因子(IL-2、IFN-y、TNF-α)的表达均明显高于对照组(P<0.001)。体外联用D-1MT后,共培养48 h和72 h后能明显提高T细胞对Raji细胞的杀伤(P<0.05),而在24h时没有明显差异(P>0.05)。虽然相应时间点对应的培养上清中Kyn的水平在联用D-1MT后基本没有变化,但T细胞无能相关基因CD98和Jumonji的表达水平在72 h时明显降低(P<0.001),且T细胞的增殖能力在48h和72h也得到部分恢复。体内抑瘤实验结果表明,尾静脉注射MSC-Tandab+PBMC并联用D-1MT对Raji移植瘤的生长具有明显的抑制作用。结论:本课题研究了人UC-MSCs作为一种治疗B-NHL的运载工具细胞。从MSCs分泌的Tandab(CD3/CD19)联合应用D-1MT可以有效地募集T细胞来抑制Raji细胞移植瘤的生长。研究结果表明UC-MSCs运载基因工程抗体联合免疫调节药物可以作为一种临床中肿瘤基因治疗的新策略。