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目的日本血吸虫病是一种严重危害人类健康的寄生虫病,目前我国沿长江流域的湖南、湖北、江西、安徽和江苏等地仍有流行[1]。早期、准确、快速的诊断此病,是防治日本血吸虫病的重要环节之一,而免疫诊断又是血吸虫病实验诊断的重要组成部分,可以弥补病原学检查的不足。但是,由于血吸虫是多细胞生物,整个生活史有不同的发育阶段,抗原组分多,相互间免疫交叉反应复杂,难以分离纯化,给血吸虫病的免疫学诊断带来极大的困难[2]。因此,国内外学者为了提高血吸虫病免疫学诊断的特异性进行了大量的研究。有文献报道,同属环节动物门的蚯蚓(Lumbricus terrestris, Lt)与日本血吸虫(Schistosoma japonica, Sj)之间存在具有免疫原性的共同交叉抗原表位[3,4],Lt作为一种异源性抗原能有效降低血吸虫和其它寄生蠕虫间的交叉反应性。研究还发现,日本血吸虫成虫可溶性抗原与蚯蚓热刺激分泌物之间也存在分子量相近且具有免疫活性的共同蛋白组分,并且推测导致这些交叉反应现象的物质基础可能是属于蛋白激酶类,如蚯蚓激酶(Lumbrukinase, Lu)的一种酶类[5]。秦志强[6]等报道日本血吸虫病患者血清中存在较多的抗水蛭可溶性抗原的抗体,用水蛭可溶性抗原检测慢性血吸虫病显示出较好的敏感性,因而水蛭也是一种值得进一步研究的血吸虫异源抗原。水蛭(Whitmania pigra, Wp)俗名蚂蝗,隶属环节动物门蛭纲类(Annelida Hirudinea),世界上有400-500种,我国约有100种,已发现89种[7]。但对于日本血吸虫成虫可溶性物质与水蛭热刺激分泌物之间的共同蛋白组分进行分析尚未见报道。鉴此,水蛭作为一种异源抗原,和蚯蚓一样在血吸虫病诊断上具有潜在的研究价值。本实验收集日本血吸虫成虫可溶性物质(Schistosoma Japonicum dissolvable, Sj-Ds)与水蛭热刺激分泌物(Whitmania pigra heat secretions, Wp-hs),利用Dot-ELISA、SDS-PAGE和Western blot技术分析两者之间的交叉反应性,采用噬菌体肽库展示技术(phage display technique, PDT)筛选获得wp-hs的抗原模拟表位,将筛选所获得的Sj-Ds和Lu的共同模拟表位作为对照,分析其氨基酸序列相似性;同时将本课题组前期筛选所获得的Sj抗原模拟表位、卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani, Pw)抗原模拟表位、旋毛虫(Trichinella spiralis, Ts)抗原模拟表位的氨基酸序列通过生物信息学方法进行比较分析,进一步探讨导致Sj间交叉反应的重要分子基础,为研究和解决临床常见蠕虫病血清免疫学诊断中交叉反应现象提供理论和实验依据。方法1.Sj-Ds与Wp-hs的制备及免疫交叉反应性分析(1) Wp-hs的制备参考热刺激产生应激蛋白的相关文献[5,8,9],取水蛭30条置于玻璃烧杯中,(40±2)℃加热30 min,收集其分泌物。另取水蛭10条置于室温(20±2)℃,放置30 min,收集其分泌物作为对照。(2) Sj-Ds的制备取新鲜Sj 200条,洗净,按1:1的比例加入PBS (0.02 mol/L,pH 7.4),在碾钵内碾成糊状后转移至组织匀浆器内再次研磨后取出,10000 rpm / min,30 min,取上清液置–20℃保存备用。(3)Sj-Ds与Wp-hs的免疫交叉反应性分析采用Dot-ELISA、SDS-PAGE和Western blot,对Sj-Ds与Wp-hs进行SDS-PAGE电泳,分析蛋白组分。电泳分离后转至硝酸纤维素膜(nitric acid cellulose membrane, NCM),并分别与日本血吸虫病患者血清和Wp-hs免疫兔血清进行反应,分析蛋白组分的交叉反应性。2.Sj与Lu、Wp-hs共同模拟表位的筛选及交叉反应性分析(1) Sj与Lu、Wp-hs共同模拟表位的筛选运用PDT,以wp-hs免疫兔血清(Wp-hs-Ig)为靶分子,原肽库扩增的第三轮肽库为源肽库进行第一轮筛选,将第一轮筛选后所得到的洗脱液继续以作为靶分子进行第二轮筛选,得到Wp-hs抗原模拟表位;同时,以Lu免疫兔血清(Lu-Ig)、日本血吸虫病患者血清(Sj-Ig)分别作为靶分子,源肽库扩增后的第三轮肽库为源肽库进行第一轮筛选,将Sj-Ig作靶分子,对用Lu-Ig筛选过的第一轮洗脱液进行第二轮筛选,同时将Lu-Ig作靶分子,对用Sj-Ig筛选过的第一轮洗脱液同法进行第二轮筛选,得到Sj与Lu共同抗原模拟表位。(2)模拟表位交叉反应性的分析采用SDS-PAGE和Western blot方法,对经筛选所获的Sj-Ds与Lu共同模拟表位进行SDS-PAGE电泳,分析蛋白组分。电泳分离后转至NCM,并与日本血吸虫病患者血清和正常人血清反应,分析蛋白组分的交叉反应性。3.分析模拟表位的氨基酸序列并与前期实验结果的氨基酸序列进行生物信息学分析利用瑞士日内瓦大学分子生物学服务器SWISS - PROT (http://www.expasy.ch/sprot/)的SWISS-PROT蛋白质数据库中,运用Blast软件分析Sj与Lu、Wp-hs抗原模拟表位共同抗原模拟表位在血吸虫蛋白质数据库和蚯蚓蛋白质数据中进行氨基酸序列相似性分析,同时运用该蛋白质数据库分析本课题组前期噬菌体筛选所得到的Sj抗原模拟表位、Pw抗原模拟表位、Ts抗原模拟表位的氨基酸序列分析。结果1.Sj-Ds与Wp-hs的制备及免疫交叉反应性分析Sj-Ds与Wp-hs之间存在着分子量(12.6～85.4 kDa)相近的蛋白条带。Wp-hs抗原在21.6～95.4 kDa分子量范围内与日本血吸虫病患者混合血清反应尤为明显,且不与正常人血清反应;Sj-Ds ( 40.1～89.0 kDa )与兔抗Wp-hs免疫血清能较好的结合。发现Sj-Ds与Wp-hs之间至少存在3种具有免疫活性的共同蛋白组分。2.Sj与Lu、Wp-hs共同模拟表位的筛选(1)模拟表位的筛选经过2轮的吸附-洗脱-扩增,获得了3个A491nm值较高的克隆,通过DNA测序,经Blast软件分析其氨基酸序列,发现Lu-Sj与血吸虫和蚯蚓的肌动蛋白四个不连续的氨基酸(LP-AI)一致;Sj-Lu与血吸虫的卵壳蛋白2A前体和蚯蚓的细胞色素氧化酶C亚单位3有三个连续的氨基酸(SSL)一致;Wp-hs与血吸虫HMG-CoA还原酶和蚯蚓的60S核糖体蛋白有四个连续的氨基酸(TRLR)一致。(2) 3个共同模拟表位交叉反应性的分析将这3个模拟表位同日本血吸虫病患者血清反应,得到分子量为65.4 kDa的交叉反应条带。3.分析模拟表位的氨基酸序列并与前期实验结果的氨基酸序列在蛋白质数据库中序列比对结果Ts4与血吸虫6-磷酸果糖激酶与蚯蚓的NADH脱氢酶亚单位5中四个不连续氨基酸(LS-PL)一致; Pw6与E3泛素蛋白连接酶和蚯蚓的NADH脱氢酶亚单位5有四个不连续氨基酸(HY-KS)是一致的;sj1与血吸虫热休克蛋白和蚯蚓的NADH脱氢酶亚单位5有四个连续氨基酸(LPGA)是一致的;结论本实验得出如下结论:1.采用SDS-PAGE、Dot-ELISA和Western blot,发现Sj-Ds与Wp-hs之间至少存在3种具有免疫活性的共同蛋白组分,说明了同属环节动物门水蛭的热刺激分泌物均与日本血吸虫成虫间存在免疫交叉反应现象。2.利用PDT筛选到Wp-hs抗原模拟表位,运用Blast软件分析,在血吸虫、蚯蚓蛋白质数据中均找到了相似的氨基酸序列,通过Western blot发现Wp-hs抗原模拟表位能与日本血吸虫病患者血清反应而不与正常人血清反应,进一步证实了Sj与wp-hs之间存在具有免疫活性的共同交叉抗原,证实水蛭热刺激分泌的抗原是一种蛋白,而这种蛋白是否属于应激蛋白,有待进一步实验证实。3.用Sj-Ig和Lu-Ig筛选噬菌体12肽库获得Lu与Sj的共同模拟表位,证实了Sj与Lt存在具有免疫活性的共同抗原,且这种免疫交叉反应物质是一种酶类。4.利用SWISS-PROT数据库,分析本课题组前期筛选所获得Sj、Pw、Ts抗原模拟表位,在血吸虫和蚯蚓蛋白质数据库中均找到了相似氨基酸序列,证实了我们以前的设想,即推测寄生蠕虫间导致交叉反应的物质是一类进化过程中高度保守的蛋白质,这种蛋白质属于应激蛋白中蛋白激酶类的一种蛋白质,且与蚯蚓蛋白数据库中的NADH脱氢酶类的酶类具有高度相似性。