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研究背景:获得表型稳定的软骨种子细胞是软骨组织工程研究的瓶颈之一。软骨细胞增殖和分化的动态变化对体内软骨的分化及表型维持至关重要,胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGFs)可以通过多条细胞内信号通路在软骨细胞的增殖和分化中发挥作用。胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-likegrowthfactor-binding proteins,IGFBPs)是一类与IGFs有高度亲和力并调控其作用的蛋白,可通过直接与IGFs结合,抑制或促进IGFs对软骨细胞增殖和分化中的作用,也可不依赖于IGFs,单独发挥对软骨细胞增殖分化的调控作用。IGFBP4是IGFBP家族成员(IGFBP1-6)之一,有研究报道IGFBP4基因敲除小鼠胚胎发育迟缓,身材矮小;我们的前期研究中也发现,2周时的组织工程软骨较8周时的组织工程软骨的IGFBP4表达水平高,提示其可能具有促进软骨分化的作用。同时,IGFBP4在多种细胞中被证实具有抑制细胞增殖的作用。而IGFBP4在软骨发育过程中的对分化和增殖的作用及机制尚无研究报道。本研究中我们利用RCJ3.1C5.18细胞系在体外建立软骨分化模型,探讨IGFBP4在软骨分化过程中维持软骨表型稳定的作用及机制,研究结果为获得表型稳定的种子细胞、构建稳定的组织工程软骨提供了理论依据和技术支持。研究目的:1.利用RCJ3.1C5.18细胞系建立体外软骨细胞分化模型,明确软骨分化各阶段细胞分化和增殖状态。2.探讨IGFBP家族成员(IGFBP1-6)在软骨细胞分化各阶段的动态表达变化。3.明确IGFBP4在软骨细胞分化过程中的作用及机制。研究方法和结果:1.应用RCJ3.1C5.18细胞系建立体外软骨细胞分化模型,明确分化各阶段细胞分化和增殖状态方法:应用生长培养基(GM)培养RCJ3.1C5.18细胞;至第4d更换为分化培养基(DM),此后每隔2d更换新鲜的DM培养液,继续培养至第10d,培养过程中在显微镜下观察细胞形态变化。分别在细胞培养的第Id,4d,7d,10d,固定细胞,应用阿利新蓝、番红O和茜素红染色液等组织学染色法对各时间点软骨细胞外基质分泌和钙盐结节形成情况进行鉴定。同时收对应时间点细胞RNA,逆转录后通过荧光定量PCR,明确各阶段细胞软骨分化相关标志基因(Col2、Sox9、Acan)、肥大分化相关标志基因(Mmp13、Coll0)和成骨分化相关标志基因(Runx2、Alp)的表达变化;Muse细胞状态分析仪检测成软骨分化各时间点细胞活力、周期和凋亡状态;结果:细胞接种后4h即可贴壁;培养第ld,细胞生长状态良好,增殖迅速,形态呈现扁平多角形;至第4d,细胞达到90%以上汇合,并呈现出立方铺路石样形态;组织学染色显示:在细胞培养前期(1-4d),软骨细胞外基质染色较深,至第4d达到峰值,钙盐几乎不着色;细胞活力和凋亡状态检测显示在此阶段细胞活力较好,凋亡率较低,至第4d时凋亡率最低,活力最好;细胞周期检测显示,第Id时,细胞处于GO/G1期比例较低,处于S期的比例较高。荧光定量PCR显示:在细胞培养前期(l-4d),软骨分化相关标志基因表达逐渐增高,并在4d达到峰值,肥大成骨分化相关标志基因表达水平较低。此后更换DM培养液继续培养至第7d,可见软骨小结样结构形成,在培养末期(l0d),细胞形态明显肥大。细胞状态活力和凋亡状态检测显示细胞活力较早期明显降低,凋亡率明显增加。细胞组织学检测显示此阶段软骨细胞外基质分泌逐渐减弱,钙盐形成明显增强,尤以软骨小结处最为明显。荧光定量PCR显示培养后期(7-l0d)软骨分化相关标志基因(Co12、Sox9、Acan)的表达较4d时明显降低,肥大分化相关标志基因(Mmpl3、Coll0)和成骨分化相关标志基因(Runx2、Alp)的表达水平明显增高。2.IGFBP家族成员(IGFBP1-6)在软骨细胞分化各阶段的动态表达变化方法:Real-time PCR检测成软骨分化各阶段(ld,4d,7d,10d)IGFBP家族各成员(IGFBPI-6)表达变化,SPSS软件分析IGFBPs表达与软骨分化不同阶段特异性基因表达的相关性。结果:IGFBP1在细胞培养前期(1-4d)表达较低,随后显著上升并于培养中后期(第7d)达到峰值;IGFBP2在培养各阶段的变化无统计学意义。相比在细胞培养前期(1-4d),IGFBP3和IGFBP5在培养后期(7-l0d)表达水平明显升高;IGFBP4和IGFBP6在培养前期(1-4d)的表达水平逐步升高,并在4d达到峰值,在培养后期(7-10d)明显降低。SPSS相关性分析显示,IGFBP2/4/6的表达趋势和软骨分化相关基因(Col2、Sox9、Acan)均呈正相关,尤以IGFBP4与Col2、Sox9的关联程度最高;而与肥大分化相关基因(Coll0、Mmp13)和成骨分化相关基因(Runx2、Alp)则均呈负相关。与之相反的是,IGFBP3/5的表达变化和软骨分化基因均呈负相关,与肥大、成骨相关基因的表达均呈正相关。3.IGFBP4在软骨细胞分化过程中的作用及机制方法:构建IGFBP4过表达与敲减的重组质粒,应用慢病毒载体转染293T细胞并收集病毒上清,感染RCJ细胞;检测过表达与敲减IGFBP4基因对RCJ3.1C5.18细胞生物学特性的影响,利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞增殖能力;利用MUSE细胞分析仪检测细胞凋亡水平及周期变化;Real-time PCR检测过表达与敲减IGFBP4对软骨分化相关标志基因的影响。蛋白芯片检测IGFBP4过表达后各通路关键蛋白磷酸化水平变化。结果:过表达IGFBP4可明显抑制肥大分化状态软骨细胞的增殖能力,使细胞更多地停留在GO/GI期,降低处于S期和G2/M期的比率,并可能通过上调Bax和Caspase-3促进凋亡;而敲减IGFBP4后,细胞的增殖、周期和凋亡均无明显变化。IGFBP4过表达可使处于肥大分化阶段的RCJ3.1C5.18细胞的肥大分化标志基因Coll0和Mmp13的表达下调,使软骨分化标志基因Sox9和Col2的表达上调;敲减IGFBP4后,软骨分化标志基因Sox9和Co12的表达明显下调。提示IGFBP4具有抑制细胞增殖并促进软骨表型表达和抑制肥大分化的作用。过表达IGFBP4后,磷酸化水平表现差异的蛋白主要富集在MAPK和PI3K-AKT信号通路上,提示IGFBP4可能通过MAPK和PI3K-AKT信号通路来发挥相应作用。研究结论:1.RCJ细胞在l-l0d的培养过程中,可依次经历软骨分化、肥大分化及成骨分化阶段,且分化不同阶段细胞具有阶段特异的增殖、周期和凋亡状态。2.IGFBP家族成员在软骨细胞分化不同阶段的表达不同,提示它们可能在软骨细胞分化的不同阶段发挥调控作用。3.过表达IGFBP4可明显抑制肥大分化状态软骨细胞的增殖能力,使细胞更多地停留在GO/G1期,降低处于S期和G2/M期的比率,并可能通过上调Bax和Caspase 3促进凋亡。4.IGFBP4过表达可使处于肥大分化阶段的RCJ3.1C5.18细胞的肥大分化标志基因Coll0和Mmp13的表达下调,使软骨分化标志基因Sox9和Co12的表达上调;敲减IGFBP4后,软骨分化标志基因Sox9和Co12的表达明显下调。结合结论4,提示IGFBP4具有抑制细胞增殖并促进软骨表型表达和抑制肥大分化的作用。5.IGFBP4可能通过MAPK和PI3K-AKT信号通路发挥相应作用。