论文部分内容阅读
背景血脑屏障主要是由脑动脉内皮细胞(Cerebral artery endothelial cell,CAEC)构成,后者常见于机体的生理活动中,如细胞或组织的相关合成及代谢功能,并分泌某种细胞因子及生物活性物质,是参与各种生理、病理活动的相关作用细胞。越来越多的研究显示肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)具有相关神经营养以及促神经生长,促进微小血管及轴突的发生、并能减少瘢痕的形成以及作用于脑室相关管膜下区(Subventricular zone,SVZ)的神经干细胞,并使其增殖、分化的作用。TGF-β1是一种确保血脑屏障完整的重要因子,肝细胞生长因子与其的作用效应根据细胞的外环境以及细胞内环境的相关活性因子的不同而不同,尤其是对神经胶质化的调控HGF-TGF-β1平衡具有重要作用。Ad-HGF感染RMMC培养上清液是通过基因工程技术构建的Ad-HGF转染RMMC得到的细胞培养上清液。根据前期Ad-HGF转染大鼠脑膜间皮细胞(rat meningeal mesothelial cells,RMMCs),我们得到了细胞培养上清液,并进行相关细胞活性的研究,期望为明确Ad-HGF感染RMMC培养上清液对大鼠的CAEC是否能促进相关的微小血管再生和相关的神经保护提供进一步的实验基础,从而为下一步临床应用Ad-HGF基因治疗老年性缺血性脑血管病提供相关实验基础。目的采用Ad-HGF转染原代培养的SD大鼠相关脑膜间皮细胞,并取得相关条件细胞培养上清液,使其作用于大鼠的CAEC,观察细胞增殖和迁移能力及细胞中的TGF-β1蛋白表达情况的影响。方法通过基因工程技术构建的Ad-HGF转染大鼠脑膜间皮细胞(rat meningeal mesothelial cells,RMMCs)得到的细胞培养上清液作用于体外原代培养SD大鼠脑动脉内皮细胞(Cerebral artery endothelial cell,CAEC),观察上清液作用后CAEC增殖和迁移能力的影响,利用分子生物学技术,通过细胞研究和整体研究,正向-反向设计,检测TGF-β1在CAEC中的表达,分析HGF-TGF-β1及相关活性因子在CAEC新生、神经再生中的作用,尝试揭示TGF-p1因子信号在促脑血管新生中的分子调控及神经保护机制作用。结果1.通过倒置相差显微镜观察大鼠脑动脉内皮细胞,常规培养96h,规范换液后,显微镜下可以看到少许细胞从脑动脉血管内侧段游出,呈不规则多角形。继续培养8-10天之后,可见细胞铺满,呈“铺路石”样,大小一致,形状均一,融合度高达90%。2.原代细胞培养8-10 d后,细胞铺满瓶底行消化传代,经传代的第3代细胞用于鉴定,HE染色,细胞呈短梭形或多角形,大小不等,细胞浆丰富,薄染为淡红色,着色均匀。3.进一步荧光显微镜下进行观察,可见传代细胞的胞核及周围胞浆内均有黄绿色荧光出现,即相关第Ⅷ因子抗原阳性,阳性率90%,其胞质与内部胞核间界限较明显,对照组细胞不染色(呈阴性),证明细胞为大鼠脑动脉内皮细胞。4.细胞迁移实验中,PVPE膜上的大量CAEC被结晶紫染色；随机选取100倍视野下细胞迁移的数量进行比较,实验组与对照组相比,差异有显著性。5.MTT实验检测Ad-HGF感染LMC培养上清液不同时间长度作用于CAEC酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值,实验组与对照组相比,差异有显著性。6.同一时间点,随着Ad-HGF感染RMMC培养上清液及外源性HGF浓度增加,CAEC中TGF-p1平均光密度值逐渐降低,TGF-p1平均光密度值呈一定量相关性,差异有显著性。结论1.采用组织块培养法及胰酶消化法可以成功获取高纯度大鼠脑动脉内皮细胞。2. Ad-HGF感染RMMC培养上清液能促进大鼠脑动脉内皮细胞的增殖和迁移。3. Ad-HGF感染RMMC培养上清液及HGF具有抑制CAEC中TGF-p1蛋白表达的作用。