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目的: FGF对于舌形成极为重要,FGF通过激活FGFR酪氨酸激酶调节着舌的发育。FGF和FGFR基因的突变都与舌畸变相关。FGF信号在舌发育中的多种机制研究主要集中在FGF7,FGF10和TGF-β,尽管FGFR1在舌间质表达且FGFR一些亚型的突变与舌畸变相关,但是对神经嵴细胞来源的间质FGFR1如何调节舌形成以及在舌发育中发挥的作用并不是非常清楚。本课题通过特异性敲除神经嵴细胞上Fgfr1,以此来研究FGFR1在舌发育中的重要作用机制。 方法: 1.利用Cre/LoxP重组系统来进行条件性基因敲除,Cre重组酶在Wnt1启动子的指引下进行表达,可以特异性敲除神经嵴细胞中Fgfr1基因LoxP内侧的片段,从而得到Fgfr1条件敲除小鼠。收集不同胚胎时期组织样品,进行基因型检测,根据PCR结果将其分为对照组和Fgfr1敲除组。 2.选择E12.5,E13.5,E14.5各个时间点对照组和Fgfr1敲除组胚胎,冠状面和矢状面进行石蜡包埋切片,H&E染色,观察不同时期舌结构形态的变化,并通过SMA荧光染色观察舌肌构成。 3.选择E12.5和E13.5对照组和Fgfr1敲除组胚胎矢状面切片,LacZ染色观察舌部细胞来源。利用免疫荧光方法分析Fgfr1敲除对不同时期舌间质细胞增殖的影响,应用TUNEL试剂盒检测舌肌细胞凋亡的改变,同时利用特征性标记蛋白分析舌上皮细胞完整性与间质细胞构成之间的关系。 4.分离野生型小鼠胚胎舌细胞,10%FBS培养细胞,给予FGFR抑制剂(AZD4547),通过免疫荧光来检测肌性调节因子Myod和desmin的变化,提取细胞RNA通过荧光定量PCR技术检测上游生长因子FGF7,FGF9,FGF10,FGF18以及肌性调节因子Myod和Myogenin等的变化,同时提取细胞蛋白质来验证蛋白水平上相关生长因子的变化。 结果: 1.与对照组小鼠胚胎舌相比,E13.5神经嵴细胞Fgfr1特异性敲除组舌体积明显变小,冠状面表现出舌上抬受限,矢状面表现舌变短,且矢状面放大图中细胞排列相对不整齐和疏松。 2. E12.5,E13.5和E14.5三个不同时期,SMA荧光染色都显示,Fgfr1敲除后肌细胞的构成发生明显改变。神经嵴细胞特异性敲除Fgfr1严重阻碍舌肌发育,破坏舌肌结构排列,特别是垂直肌,横向肌以及颏舌肌这些部分,同样的舌间质细胞的排列分布也发生了改变。Fgfr1敲除使舌前端颅神经嵴来源的间质细胞明显减少,但是并不影响舌上皮细胞的完整性。E12.5和E13.5矢状面SMA和pH3共同染色显示,与对照组相比,Fgfr1敲除组舌肌细胞增殖明显降低。 3.体外分离培养E12.5,E13.5小鼠胚胎舌间质细胞,与对照组相比,FGFR抑制剂促进舌间质细胞分化,肌性指标(Desmin)表达增加且阳性细胞肌纤维长度增加;与对照组相比,给药组FGF9,FGF18,Myod mRNA表达量水平显著增加,而FGF7,TGF-β mRNA表达量显著降低。体外分离培养E13.5小鼠胚胎舌间质细胞,与对照组相比,在蛋白水平上给药组舌间质细胞LC3表达增加, FGF9表达减少。 结论: 神经嵴细胞条件性敲除Fgfr1明显影响小鼠胚胎舌的上抬及伸长,抑制舌肌细胞增殖,促进舌间质细胞凋亡,使舌前端间质细胞构成发生改变;体外给予抑制剂后,舌间质细胞分化程度明显增加,并且促进细胞自噬,降低FGF9蛋白表达,FGFR1可能通过FGF7、FGF10、FGF18、TGFβ等基因的表达影响舌肌细胞增殖、凋亡和分化从而调控舌发育。