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HMPV是近年来发现的一种呼吸道病毒,呈全球流行,能够引起人类急性呼吸道感染。HMPV被认为是5岁以下儿童死亡的主要原因,严重影响了全球86%以上的5岁以下儿童健康。但目前尚无FDA和NMPA批准的疫苗上市,因此HMPV疫苗的研制亟待解决。流感病毒为载体的重组病毒rFLU-HMPV/F-NS的拯救:通过生物信息学和文献查阅综合分析,设计合成了含HMPV F蛋白主要抗原表位及缺失部分NS1核苷酸序列重组序列,将其插入p HW2000载体,构建重组质粒pFLU-HMPV/F-NS,经反向遗传学技术成功拯救获得重组病毒rFLU-HMPV/F-NS。重组病毒经鸡胚稳定盲传5代,经超速离心法浓缩、30%～60%蔗糖密度梯获得纯化的重组病毒,测定其P1～P5血凝效价及TCID50病毒滴度分别为27~10,107~9TCID50/m L。细胞免疫荧光结果显示重组病毒rFLU-HMPV/F-NS成功表达HMPV F蛋白及PR8 NP蛋白;电镜观察发现重组病毒rFLU-HMPV/F-NS的大小分布及粒子结构符合流感病毒的形态特征。重组病毒rFLU-HMPV/F-NS免疫小鼠实验:6周龄的雌性BALB/c小鼠,随机分为3组,设低剂量组(10~4TCID50)和高剂量组(10~6TCID50),PBS为对照组。所有实验小鼠经滴鼻共免疫2次,第1次免疫28 d后进行第2次免疫,每次免疫前及第2次免疫后14 d采集血清样品,同时第2次免疫后14 d各组取鼻肺灌洗液和小鼠脾脏,用于评价重组病毒rFLU-HMPV/F-NS的免疫效果。实验结果表明,血凝抑制试验（HI）检测第1次免疫28 d后和第2次免疫14 d后小鼠血清中抗流感A/China/BJMY011/2020（H1N1）病毒株血凝抑制抗体效价,与PBS对照组相比,第1次免疫及第2次免疫的低剂量组和高剂量组均能诱导小鼠机体产生高效的抗流感病毒的血凝抑制抗体,差异极显著（p＜0.01）,且第2次免疫高剂量组和低剂量组的抗体效价均高于第1次免疫,差异极显著（p＜0.01）,同时第1次免疫与第2次免疫后高剂量组抗体效价均高于低剂量组,但无显著差异（p＞0.05）,由此可见用低剂量免疫小鼠即可获得较高的抗流感病毒体液免疫应答反应;微量中和试验结合Q-PCR检测小鼠血清抗HMPV中和抗体,ELISA检测血清抗HMPV特异性Ig G抗体,与PBS对照组相比,高剂量组和低剂量组均能诱导小鼠机体产生显著的抗HMPV中和抗体和抗HMPV特异性Ig G ELISA抗体,差异极显著（p＜0.01）,第2次免疫抗体效价均高于第1次免疫,差异极显著（p＜0.01）。高剂量组抗体效价高于低剂量组,但无显著差异（p＞0.05）。由此可见用低剂量免疫小鼠即可诱导机体产生较高的抗HMPV体液免疫应答反应。ELISA检测重组病毒rFLU-HMPV/F-NS第2次免疫14 d小鼠肺灌洗液中HMPV特异性s Ig A抗体效价,与PBS对照组相比,高剂量组和低剂量组免疫2次后小鼠黏膜分泌的HMPV特异性s Ig A抗体水平极显著增高（p＜0.01）,且高剂量组HMPV特异性s Ig A抗体效价可达102.508±0.100。由此表明,低剂量重组病毒rFLU-HMPV/F-NS即可诱导机体产生黏膜免疫反应。流式细胞术分析检测重组病毒rFLU-HMPV/F-NS第2次免疫14 d后小鼠脾淋巴细胞产生的HMPV特异性的细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-2、和IL-4）水平,与PBS对照组相比,重组rFLU/HMPV/F/NS病毒低剂量组诱导的HMPV特异性的Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ以及Th2型细胞因子IL-4极显著升高（p＜0.01）,Th1型细胞因子IL-2显著升高（p＜0.05）,高剂量组诱导的HMPV特异性的Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2以及Th2型细胞因子IL-4极显著升高（p＜0.01）。由此可见高剂量组和低剂量组均能诱导产生HMPV特异性Thl/Th2免疫应答,且趋于Th1型细胞免疫反应。由此可见重组病毒可以诱导小鼠产生有效的抗甲型流感病毒及抗HMPV体液免疫和抗HMPV黏膜免疫及Th1型细胞免疫反应,且低剂量就可获得较好的效果;重组病毒rFLU-HMPV/F-NS的免疫保护效果:分别用当前流感病毒流行毒株A/China/BJMY011/2020（H1N1）株(攻毒剂量为15LD50/只)和HMPV-BJ1812病毒株（攻毒剂量为10~6PFU/只）攻击第2次免疫14 d后的2组小鼠（低剂量组,高剂量组）及PBS组,以不攻毒的PBS组作为空白对照组,共7组,每组9只,经滴鼻接种。结果显示,流感病毒A/China/BJMY011/2020（H1N1）毒株攻击后,与PBS对照组相比,低剂量组小鼠体重稍有波动,高剂量组小鼠体重维持稳定,且两组免疫小鼠无死亡现象。小鼠肺组织流感病毒TCID50测定结果显示,低剂量组及高剂量组流感病毒TCID50较PBS对照组极显著降低（P＜0.01）。小鼠肺病理切片结果显示,低剂量组及高剂量组小鼠肺组织均表现出轻于PBS对照组小鼠的病理损伤。HMPV-BJ1812毒株攻击后,与PBS对照组相比,低剂量组小鼠体重变化有小幅波动,高剂量组小鼠体重呈稳定趋势。HMPV-BJ1812毒株攻击小鼠后,不会对其产生致死作用。病毒载量结果显示,免疫组小鼠肺组织病毒载量较PBS对照组极显著降低（P＜0.01）。肺病理结果显示,与PBS对照组小鼠相比,免疫组小鼠肺组织病理损伤减轻。由此可见免疫小鼠对甲型流感病毒及HMPV攻毒感染,可以获得有效的免疫保护。本研究成功构建了重组病毒rFLU-HMPV/F-NS,并证明其具有良好的免疫原性,可以诱导小鼠产生有效的抗甲型流感病毒及抗HMPV体液免疫和抗HMPV黏膜免疫及Th1型细胞免疫反应;免疫小鼠对甲型流感病毒及HMPV攻毒感染,可以获得有效的免疫保护,且低剂量即可获得较好的效果,为发展新型HMPV疫苗提供了实验数据及研究思路。为筛选重组HMPV疫苗候选株及实现“一苗两用”提供了实验依据。