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目的:研究三氧化二砷对胃癌SGC7901细胞体外增殖、凋亡及对细胞内Nur77/Bcl-2信号转导通路的影响；为研究三氧化二砷体外诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制提供新的线索。
方法:
1.用不同浓度的三氧化二砷(5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L)处理体外培养的胃癌SGC7901细胞,应用细胞活性计数方法(Cell Counting Kit-8,CCK-8法)检测不同浓度三氧化二砷处理不同时间(24h、48h)对SGC7901细胞体外生长的影响。
2.观察SGC7901细胞经IC50浓度的三氧化二砷处理24h后引起的细胞核形态学变化,采用DAPI染色法荧光显微镜下检测。
3.采用Annexin V-FITC法测定不同浓度的三氧化二砷(5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L)处理24h后,对SGC7901细胞早期凋亡率及晚期凋亡率的影响。
4.采用细胞免疫荧光法检测15μmol/L三氧化二砷处理不同时间(3h、6h、12h)后,对SGC7901细胞内Nur77蛋白胞内分布的影响。采用蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测15μmol/三氧化二砷处理不同时间(3h、6h、12h、24h)后,对SGC7901细胞内Nur77表达量的影响。
5.采用细胞免疫荧光法检测15μmol/L三氧化二砷处理12h后,SGC7901细胞内Bcl-2 BH3结构域暴露、Bax激活的情况。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测15μmol/三氧化二砷处理不同时间(3h、6h、12h、24h)后,对SGC7901细胞内BH3结构域暴露的Bcl-2、激活状态的Bax、Bcl-2总蛋白和Bax总蛋白表达量的影响。
结果:
1.不同浓度的三氧化二砷(5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L)处理24h后,细胞生长抑制率分别为16.50±0.55％,50.83±0.75％,65.50±1.05％,73.50±1.05％；作用48h后细胞生长抑制率分别为41.83±0.75％,61.67±0.82％,71.17±0.75％,76.67±0.82％。计算出在24h三氧化二砷对SGC7901细胞生长的IC50约为10μmol/L。
2.免疫荧光显微镜下可见经10μmol/三氧化二砷作用24h后,SGC7901细胞核出现典型的凋亡形态改变,如细胞核呈折缝样、染色质出现浓缩、核膜破裂、染色质固缩、细胞核裂解为碎块。
3.采用Annexin V-FITC法测定细胞凋亡率,结果显示对照组和不同浓度(5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L)的三氧化二砷处理SGC7901细胞24h的早期凋亡率分别为1.49±0.63％、2.28±1.46％、3.97±1.28％、16.94±3.42％、21.50±4.51％、19.16±4.21％、21.53±4.16％；晚期凋亡率分别为3.52±0.49％、4.21±0.48％、4.42±1.12％、7.92±0.61％、23.02±1.46％、26.80±1.86％、19.39±1.23％。
4.采用细胞免疫荧光法检测15μmol/L三氧化二砷作用不同时间(3h、6h、12h),结果显示:SGC7901细胞内的Nur77蛋白从细胞核向细胞浆转移,在三氧化二砷处理12h时最明显。Western blot结果显示:15μmol/L的三氧化二砷作用不同时间(3h、6h、12h、24h),Nur77的表达量有逐渐增强的趋势。
5.采用细胞免疫荧光法检测15μmol/L三氧化二砷作用12h,结果显示:SGC7901细胞内的BH3暴露状态的Bcl-2蛋白和激活状态的Bax蛋白染色明显增强；Westernblot结果显示:15μmol/L的三氧化二砷作用不同时间(3h、6h、12h、24h),BH3暴露状态的Bcl-2蛋白呈上调趋势,在12h达到峰值,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);随着作用时间的延长,激活状态的Bax蛋白的表达量呈上调趋势,24h达到峰值,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。15μmol/L的三氧化二砷作用不同时间(3h、6h、12h、24h),总Bcl-2的表达量变化不明显,各组间差异均无统计学意义(P>0.05)；总Bax的表达上调,3h达到峰值,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),随后逐渐下降。
结论:
1.胃癌SGC7901细胞经三氧化二砷处理后,细胞生长受到抑制,随着时间延长和浓度增加,细胞生长抑制率增大。
2.三氧化二砷能诱导SGC7901细胞凋亡的发生。
3.在三氧化二砷诱导SGC7901胃癌细胞的凋亡中伴随着Nur77的出核、Nur77的表达上调、Bcl-2蛋白构象改变和Bax激活,提示三氧化二砷可以影响Nur77/Bcl-2凋亡信号转导通路。