背景和目的:高原低压低氧环境对快速进入高原的人的认知功能,如短时记忆、注意广度及注意转化能力、思维判断能力均产生不利影响,进而影响人正常的生活、工作和学习。随着高原地区经济社会的发展,进入高原地区人数逐年增加,这种影响的危害性越来越显著。此外,从军事角度来看,未来战争快速推进及跨区战略投送呈常态化,认知功能受损导致的军事作业能力下降将极大地削弱战斗力。目前针对急进高原初期认知功能障碍的防治措施主要有两类:阶梯适应性训练和化学合成药物(如乙酰唑胺)干预,适应性训练需要特定条件且耗时长,化学合成药物干预的安全有效的作用剂量范围较窄且难以祛除有害作用。而研究发现广泛存在于自然界的植物化学物有着多种生物化学功能,能发挥有效的抗氧化应激、抗炎等作用,且较少产生副作用。因此,开展可减轻急进高原初期认知功能障碍、促进高原认知功能快速适应的天然植物化学物的研究,提供及时的、有效的生物医学解决方案,有着较大的现实意义。记忆能力在诸多认知功能中占重要地位。虽然低压低氧环境下机体发生记忆能力损伤的机制尚不明确,但活性氧产生增多导致的氧化应激水平过高在低压低氧环境下记忆能力损伤的发生中占重要地位,作为活性氧主要产生部位的线粒体和易受氧化应激损伤的神经元突触亦参与其中。如何保护低压低氧环境下的线粒体和神经元突触是减轻记忆能力损伤的一个重要作用靶点。越来越多的研究证据显示,植物化学物具多种生物化学功能,其中多酚类化合物更是受到较多关注和研究,能够发挥有效的抗氧化应激作用。此外动物实验发现多酚类化合物可发挥对脑缺血再灌注损伤中神经元的保护作用,且可改善病理状况下线粒体的状态。低压低氧导致的机体损伤变化,与缺血再灌注导致的损害改变相类似。基于以上分析,我们推测,以多酚类化合物调节神经元线粒体稳态及改善神经元突触结构来减少低压低氧环境下神经元的损伤,可能会成为减轻低压低氧环境下机体记忆能力损伤的一条有效途径。本研究拟利用动物实验和细胞实验相结合的方法,从动物和细胞水平研究对低压低氧环境下机体认知记忆能力损伤具有保护效应的多酚类化合物及其作用机制。在模拟高原低压低氧环境中建立大鼠记忆能力损伤模型,并在此动物模型基础上检测四种常见多酚类化合物-白藜芦醇(resveratrol,rsv)、槲皮素(quercetin,que)、二氢杨梅素(dihydromyricetin,dhm)和杨梅素(myricetin,myr)对大鼠记忆能力损伤的作用,发现que和dhm能明显减轻大鼠记忆能力损伤;围绕que和dhm发挥作用的靶点和机制,探索了线粒体稳态、神经元突触结构改变和相关信号蛋白表达水平在其中发生的变化,并阐明sirt3/foxo3信号通路在dhm保护低压低氧环境下大鼠记忆能力的作用。方法:本研究采用低压氧舱模拟海拔5000m低压低氧环境,雄性sd大鼠暴露于低压低氧环境下1、3、7、14d后利用morris水迷宫检测不同暴露时长后大鼠空间记忆能力的变化,比较分析后选择7d为暴露时长建立低压低氧环境下大鼠记忆能力损伤模型,并以此模型为基础进行下一步实验。rsv、que、dhm和myr四种常见多酚类化合物分别以梯度剂量(50、75、100mg/kg.bw/d)灌胃暴露于低压低氧环境下的大鼠,7d后利用morris水迷宫检测大鼠空间记忆能力的变化,发现100mg//kg.bw/d剂量的que(que100)和100mg/kg.bw/d剂量的dhm(dhm100)对低压低氧环境下大鼠记忆能力具有显著的保护作用。围绕que和dhm发挥作用的靶点和机制,利用透射电镜(transmissionelectronmicroscopy,tem)观察que和dhm对低压低氧环境下大鼠海马神经元线粒体和突触结构的影响,利用实时荧光定量pcr(quantitativerealtime-polymerasechainreaction,qrt-pcr)检测线粒体dna相对拷贝数的变化,通过基于酶联免疫技术的微孔板检测线粒体呼吸链酶复合体活性的变化,使用蛋白质免疫印迹(westernblot,wb)技术检测线粒体生成相关蛋白过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α(αsubunitofperoxisomeproliferators-activatedreceptor-γcoactivator-1,pgc-1α)、核呼吸因子1(nuclearrespiratoryfactor1,nrf1)、线粒体转录因子a(mitochondrialtranscriptionfactora,tfam),线粒体融合蛋白1(mitofusin1,mfn1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin2,mfn2)、线粒体分裂蛋白1(mitochondrialfissionprotein1,fis1)、发动蛋白相关蛋白1(dynamin-relatedproteinl,drpl)、纤维连结蛋白iii型域包含蛋白5(fibronectintypeiiidomaincontaining5,fndc5)、脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,bdnf)、神经元突触素(synaptophysin,syp)及突触后密度蛋白95(postsynapticdensityprotein95,psd95)表达水平变化,探索sirt1/pgc-1α/nrf1/tfam和pgc-1α/fndc5/bdnf通路是否参与了que对线粒体稳态和神经元突触改变的作用。利用三气培养箱建立ht-22细胞低氧模型,在此基础上利用wb、免疫沉淀(immunoprecipitation,ip)及荧光分子探针研究sirt3/foxo3通路在dhm通过调节线粒体稳态、细胞内活性氧水平及抗氧化应激作用来减轻低压低氧环境下大鼠记忆能力损伤中所发挥的作用。实验结果:1.大鼠分别暴露于模拟海拔5000m低压低氧环境中1、3、7、14d,morris水迷宫检测大鼠空间记忆能力后发现与常氧对照组大鼠相比,7d和14d的暴露使得大鼠空间记忆能力显著下降;且暴露14d后大鼠空间记忆能力下降程度与暴露7d后的大鼠相比没有统计学差异。因此选择7d作为建立低压低氧下大鼠记忆损伤模型的暴露时长。2.大鼠暴露于低压低氧环境下时(7d),四种多酚类化合物:rsv、que、dhm和myr分别以梯度剂量(50、75、100mg/kg.bw/day)灌胃干预大鼠7d,并在低压低氧暴露结束后利用morris水迷宫检测大鼠空间记忆能力,发现与低氧对照组相比,que100和dhm100均可明显减轻大鼠的记忆能力损伤。而morris水迷宫测试没有观察到rsv和myr各剂量干预组大鼠记忆能力损伤与低氧对照组大鼠相比有明显减轻。3.tem观测结果显示que100和dhm100均能显著改善低压低氧导致的海马神经元中线粒体结构异常和突触后致密物减少;qrt-pcr结果显示,与低氧对照组相比,que100和dhm100均使大鼠海马神经元线粒体dna相对拷贝数明显增加;基于酶联免疫技术的微孔板检测发现,与低氧对照组相比,que100大鼠海马组织线粒体呼吸链酶复合体Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ活性明显升高,dhm100干预组大鼠海马组织线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ活性显著升高;蛋白免疫印迹实验表明,que100干预组大鼠海马组织pgc-1α、sirt1蛋白、线粒体生成相关蛋白nrf1、tfam及线粒体融合相关蛋白mfn1、mfn2表达水平显著高于低氧对照组,而que100大鼠海马组织线粒体分裂相关蛋白fis1、drp1表达水平显著低于低氧对照组;此外que100大鼠海马组织神经生长因子bdnf和fndc5蛋白表达水平明显高于低氧对照组。脂质过氧化物水平检测显示dhm100干预组大鼠海马组织mda水平显著低于低氧对照组。蛋白免疫印迹实验表明,dhm100干预组大鼠海马组织sirt3蛋白表达水平明显高于低氧对照组,而foxo3乙酰化水平明显低于低氧对照组。此外,dhm100干预组大鼠海马神经元线粒体生成相关蛋白pgc-1α、tfam和神经元突触相关蛋白syp、psd95表达水平显著高于低氧对照组。4.低氧环境下培养ht-22细胞,发现dhm干预减轻了低氧导致的ht-22细胞线粒体dna相对拷贝数下降,增强了ht-22细胞线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性并增加了ht-22细胞atp水平,降低了ht-22细胞脂质过氧化水平、细胞内活性氧水平和线粒体超氧化物水平,能上调sirt3蛋白表达水平,同时降低foxo3乙酰化水平,可上调线粒体生成相关蛋白pgc-1α、tfam和突触相关蛋白syp、psd95表达水平。采用sirt3sirna转染ht-22细胞沉默sirt3蛋白表达后,没有观察到dhm对低氧环境下培养的ht-22细胞的foxo3乙酰化水平的影响。采用sirt3sirna或foxo3sirna转染ht-22细胞沉默sirt3或foxo3蛋白表达后,没有观察到dhm对低氧环境下培养的ht-22细胞线粒体dna的相对拷贝数、线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性、ht-22细胞atp水平、ht-22细胞脂质过氧化水平、细胞内活性氧水平和线粒体超氧化物水平及线粒体生成相关蛋白pgc-1α、tfam和突触相关蛋白syp、psd95表达水平的显著影响。实验结论:1.成功建立模拟高原低压低氧环境下大鼠记忆能力损伤模型,发现在模拟海拔5000m低压低氧环境下暴露7d后大鼠空间记忆能力受到明显损伤。2.比较研究四种常见多酚类化合物对低压低氧环境下大鼠记忆能力的保护效应,发现que和dhm均可明显减轻低压低氧环境下大鼠记忆能力的损伤,而rsv和myr对低压低氧环境下大鼠记忆能力的损伤无显著性保护作用。3.que和dhm均可以有效改善低压低氧环境下大鼠海马神经元线粒体生成、结构和功能,并能显著减轻海马神经元突触结构损伤。4.que能有效调节低压低氧环境下大鼠海马神经元线粒体的融合分裂相关蛋白表达水平并能促进脑源性神经营养因子bdnf表达水平。sirt1/pgc-1α/nrf1/tfam通路参与了que对线粒体稳态的调节作用,pgc-1α/fndc5/bdnf参与了que对神经元突触结构的保护作用。5.利用ht-22细胞低氧损伤模型和sirna转染技术,发现dhm可通过sirt3去乙酰化foxo3进而调节线粒体稳态,包括有效改善线粒体生成、结构和功能,同时显著降低线粒体超氧化物水平、细胞内活性氧水平和氧化应激水平,保护突触结构,进而发挥保护神经元功能的作用。综上所述,本课题研究了四种常见多酚类化合物对急进高原初期机体记忆能力损伤的保护适应及其分子机制,为理解高原低压低氧环境下记忆能力损伤发生的分子机制及防治靶点提供了新的思路,有益于探索研发安全有效的抗高原反应防治药物。