磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B信号转导通路在急性坏死性胰腺炎中性粒细胞活化中的作用前言急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）因病情发展迅速、死亡率高而成为学者们研究的热点。ANP的发病机制十分复杂，目前认为是一种由多种炎症介质参与，以中性粒细胞、单核巨噬细胞和内皮细胞为效应细胞的全身性炎症反应。随着对ANP发病机理研究的深入，人们逐渐认识到ANP时出现的全身炎症反应综合征（systemic inflammation response syndrome，SIRS）及由此引起的多脏器功能衰竭（multiple organ failure，MOF）是ANP高死亡率的主要原因，阻断SIRS发生的某一环节将有助于减少MOF的发生，降低死亡率。越来越多的证据表明：ANP时各种炎性细胞产生的促炎细胞因子是导致SIRS发生的关键因素，因此学者们推测采用细胞因子抗体或其它拮抗细胞因子的方法可能会减轻ANP的炎症反应，后来的实验虽然证实了这一结论，但是治疗结果并不理想。究其原因在于ANP时SIRS的发生是通过许多细胞因子构成的一个复杂的细胞因子网络介导的，细胞因子的数量众多且存在互相协同、互相诱生等多种复杂的相互作用，因此，单独阻断某一个或少数细胞因子的作用很有限，往往达不到治疗目的。如何才能有效调控细胞因子的产生，阻断SIRS和MOF的发生，对于ANP的防治研究具有重要意义。尽管现在发现参与炎症反应的细胞因子数量众多，但细胞内参与调控细胞因子产生的信号转导通路却并不多。如能对关键的信号转导通路进行有效的阻断和调节，则可以十分有效地调控促炎细胞因子的产生，从而阻断SIRS和MOF的发生或减轻其严重程度，进而提高治疗效果。因此研究信号转导通路在ANP发病机制中的作用具有重要意义。磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase／protein kinase B，PI3K／PKB）信号转导通路因在炎症细胞活化、趋化及凋亡方面发挥了重要的调节作用而成为研究的热点。PI3K／PKB信号转导通路是介导细胞外信号引起细胞反应的重要信号调控系统，在肿瘤的发生、应激反应、炎症、缺血再灌注损伤、免疫调控等领域发挥着极其重要的作用。PI3K是一个异二聚体复合物，其p110的催化亚单位包括α、β、γ、δ4种类型，IA型PI3Ks的p110α、p110β、p110δ与p85调节亚单位结合，IB型PI3K的p110γ与p101转接分子结合，后者通过与G蛋白偶联受体结合而活化。PKB是PI3K产生的磷脂酰肌醇3，4-P₂和磷脂酰肌醇3，4，5-P₃的主要靶分子，可以因PI3K的活化而被磷酸化。p-PKB可以进一步导致IκBα磷酸化，致使IκBα与核因子NF-κB解离，NF-κB被活化并进入细胞核，结合到特定的启动子或促进子上进而提高炎性介质基因的转录活性，最终导致细胞产生大量细胞因子。因而PI3K／PKB信号转导通路是调节细胞因子产生的主要信号转导通路，在机体炎症反应调控过程中起着极其重要作用。学者们通过对创伤、烧伤、感染性休克等动物模型的研究表明：PI3K／PKB信号转导通路是调控这些炎症反应的主要信号转导通路，抑制了PI3K／PKB信号转导通路的激活就可以减少细胞因子的产生，显著提高实验动物的生存率。目前国内对于PI3K／PKB信号转导通路在ANP发病机制中的作用还缺乏系统研究，故我们对此进行探讨，旨在从信号转导通路水平了解ANP的发病机制，为ANP的治疗提供新的思路和办法，以期提高治疗效果。材料与方法一、实验材料与仪器SD大鼠（体重250～300g），由中国医科大学实验动物中心提供。戊巴比妥钠；Dextran T-500；淋巴细胞分离液Ficoll-Paque Plus；牛磺胆酸钠；胰蛋白酶；渥曼青霉素（Wortmannin）；LY294002；RNAout；RT-PCR试剂盒；蛋白激酶B（PKB或p-PKB）抗体；聚偏二氟乙烯蛋白印迹膜；大鼠TNF-α和IL-1β酶联免疫试剂盒；SABC法免疫组化试剂盒；MPO检测试剂盒等。细胞培养工作台、SANYO MDF-U超低温冰箱、OLYMPUS AX70倒置显微镜、GFL THERMOLAB振荡水浴箱、高速冷冻离心机、DYY-6C型电泳仪、半干转印仪、ChemiImager5500自动电泳凝胶成像分析仪、PTC-100型PCR扩增仪、水平板电泳系统、GLS-700D数码凝胶扫描分析系统、A-200 Ds电子天平、B-Brown微量泵、PH计等。二、实验方法（一）中性粒细胞的分离与鉴定密度梯度离心法分离中性粒细胞，瑞—吉氏染色鉴定细胞纯度。（二）急性坏死性胰腺炎模型的建立胆胰管逆行注射牛磺胆酸钠法建立急性坏死性胰腺炎模型。（三）实验分组和取材首先将体外分离的中性粒细胞分为4组：对照组（C）、胰蛋白酶组（T）、胰蛋白酶+渥曼青霉素组（W）和胰蛋白酶+LY294002组（L）。W、L组先分别给予Wortmannin（终浓度为200nmol／L）和LY294002（终浓度为100μmol／L）预处理1h，然后分别给T、W及L组予胰蛋白酶（终浓度为40nmol／L）刺激1h。处理结束后收集中性粒细胞及培养液，ELISA法检测培养液TNF-α和IL-1β的含量、RT-PCR和蛋白印迹法检测TNF-α和IL-1βmRNA及p-PKB／PKB蛋白表达。在第二部分，将40只大鼠随机分为正常对照组和四个ANP组（分别为胰腺炎3、6、12、24h）。在各时间点分别采血分离中性粒细胞，检测细胞内p-PKB蛋白及TNF-α和IL-1βmRNA的表达。第三部分，将24只大鼠随机分为3组：正常对照组（C）、ANP组（S）和ANP+Wortmannin组（W），ANP+wortmannin组于制模前4h给与wortmannin 1.4mg／kg腹腔内注射，模型制成6h后重新麻醉开腹，取血分离中性粒细胞及血清，待后期ELISA、RT-PCR和Western检测，并取胰腺及肺脏组织，置于-70℃的冰箱中保存待测MPO、湿干比、病理学检测及免疫组化染色。肺组织取材方法：切取右肺下叶，使用聚乙烯导管插管入左主支气管后固定，以30cmH₂O的压力向支气管树内注入10％的中性福尔马林液，直至肺脏均匀膨胀后，切除左肺上叶，置于中性福尔马林中36h。（四）检测方法1、免疫蛋白印迹杂交（Western blot）检测中性粒细胞内p-PKB／PKB蛋白表达。2、RT-PCR方法检测中性粒细胞内TNF-αmRNA和IL-1βmRNA的表达。3、酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养液及血清中TNF-α和IL-1β的含量。4、免疫组织化学染色采用链霉亲合素—生物素—过氧化物酶复合物（streptavidin-biotin complex，SABC）法，检测肺组织NF-κB的表达。5、苏木素—伊红（HE）染色检测胰腺及肺脏组织的病理改变。6、检测肺组织MPO活性及湿／干质量比。（五）统计学处理实验数据采用均数±标准差（（?）±s）表示，用SPSS 12.0统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05差异具有显著性。实验结果一、PI3K／PKB信号转导通路在胰蛋白酶激活中性粒细胞中的作用中性粒细胞在基础状态下PKB总蛋白表达丰富，但磷酸化水平较低；对照组的中性粒细胞有少量TNF-α和IL-1βmRNA表达。40nmol／L胰蛋白酶作用中性粒细胞后p-PKB水平迅速升高，与对照组比较增加明显（P＜0.05）；TNF-α和IL-1β蛋白及mRNA的表达也出现了同样的趋势。细胞在受到胰蛋白酶刺激前1h预先给予PI3K抑制剂Wortmannin（200 nmol／L）或LY294002（100μmol／L）后，完全阻断了胰蛋白酶对中性粒细胞p-PKB的激活作用，与胰蛋白酶刺激组比较差异显著（P＜0.05）；TNF-α和IL-1β蛋白及mRNA的表达也随着p-PKB活性的被抑制而表达减弱。二、急性坏死性胰腺炎大鼠外周血中性粒细胞内PI3K／PKB信号转导通路的动态变化模型制成后3小时胰腺呈暗红色，淤血水肿，未见明确坏死灶；6小时后胰腺颜色略减轻但淤血水肿更明显，出现局灶坏死及多处皂化斑，腹腔出现中等量的淡血性腹水；12小时后胰腺呈苍白色，可见大片紫黑色或暗绿色的坏死灶，腹腔可见广泛的皂化斑及大量的血性腹水，胃肠极度扩张；24小时的情况与12小时的基本相同。对照组大鼠的中性粒细胞内PKB总蛋白表达丰富，活性为169.3±13.3，p-PKB也有基础表达，活性为24.8±4.9。制模后中性粒细胞内磷酸化PKB水平迅速升高，3小时就明显增加，活性为47.1±8.6，至24小时达到高峰，与对照组比较增加明显（P＜0.05）。虽然12小时组比6小时组稍有降低，但仍维持较高水平，显著高于3小时组（P＜0.05）。造模后各时间点与造模前比较均有统计学差异（P＜0.05）。对照组大鼠的中性粒细胞内有少量TNF-α及IL-1βmRNA表达，活性分别为0.08±0.05和0.26±0.09。制模后中性粒细胞内TNF-α及IL-1βmRNA表达水平迅速升高，3小时就明显增加，活性分别为0.34±0.08和0.41±0.09，两种细胞因子分别至6及12小时达到高峰，活性分别为0.83±0.16和0.87±0.14，24小时仍维持较高水平，活性分别为0.63±0.10和0.65±0.11。造模后各时间点的水平与造模前比较均有统计学差异（P＜0.01）。三、PI3K／PKB信号转导通路抑制剂对急性坏死性胰腺炎大鼠及中性粒细胞分泌促炎细胞因子功能的影响急性坏死性胰腺炎模型制成后胰腺炎大鼠外周血中性粒细胞内p-PKB水平及TNF-α和IL-1βmRNA含量均较对照组明显升高（P＜0.05），wortmannin能显著抑制中性粒细胞内PKB的磷酸化及TNF-α和IL-1βmRNA的产生，同时可以明显降低血中TNF-α和IL-1β蛋白的水平。胰腺炎肺组织的MPO水平及肺湿／干重比较对照组增加明显，Wortmannin能降低肺湿／干重比和MPO。同时病理学检查发现Wortmannin还可以明显减轻肺损伤，降低肺组织的病理评分。但并不能改善胰腺组织出血、坏死等病理改变，只能减少组织炎性细胞浸润的程度。研究同时发现制模后肺组织中增加的NF-κB表达水平也因Wortmannin的应用而表达减少。结论1、中性粒细胞表面的PAR-2被胰蛋白酶激活后通过PI3K／PKB信号转导通路进行信号转导。2、中性粒细胞表面的PAR-2活化后炎性介质TNF-α和IL-1β的mRNA及蛋白表达明显增加。3、磷脂酰肌醇3激酶抑制剂Wortmannin和LY294002能够阻断胰蛋白酶对中性粒细胞的激活作用，减少炎性介质的产生。4、中性粒细胞内PI3K／PKB信号转导通路在急性坏死性胰腺炎早期被激活，参与了细胞活化的调控。5、阻断PI3K／PKB信号转导通路可以有效抑制急性坏死性胰腺炎早期中性粒细胞分泌促炎细胞因子TNF-α和IL-1β。6、PI3K／PKB信号转导通路抑制剂可以明显减轻急性坏死性胰腺炎时的全身炎症反应。