论文部分内容阅读
第一部分β-caten in及DDK1在URSA患者的绒毛滋养层细胞和蜕膜组织中表达目的原因不明复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)在临床上一直是比较难治疗的不育疾病,占复发性流产的60%-70%。研究发现许多信号途径对早期成功妊娠很重要,其中Wnt信号通路是一条高度保守的信号通路,在细胞的增殖、分化、转移、极性、粘附及干细胞的更新等过程起重要的调节作用。Wnt/β-catenin信号通路的适度激活可促进绒毛滋养细胞的侵袭和子宫内膜蜕膜化,为胚胎的成功着床提供条件,但目前其具体的调控机制仍未充分阐明。尽管有研究表明DDK1在复发性流产的病人中表达上调,然而Wnt/β-catenin的异常表达与不明原因复发性流产的关系尚未充分阐明。本课题第一部分拟通过研究P-catenin及DKK1(Dickkopf-1)在不明原因复发性流产绒毛及蜕膜组织中的表达情况,探讨Wnt/β-catenin信号途径在复发性流产中的调控作用。方法取不明原因复发性流产及正常妊娠早孕绒毛及蜕膜组织各20例,本研究中选择的所有不明原因复发性流产患者连续发生自然流产的次数均超过2次,患者年龄在26-36岁。正常流产患者为同期非意愿早期妊娠,主动要求终止妊娠患者。用免疫组化及Western blot分别检测不明原因复发性流产及正常孕妇妊娠早孕期绒毛及蜕膜组织中β-catenin的定位及蛋白水平的表达,用实时荧光定量PCR分别检测蜕膜及绒毛组织中β-catenin和DDK1 mRNA的水平。结果1.免疫组化显示β-catenin主要分布在绒毛滋养层细胞膜上,部分分布在细胞质和细胞核内,蜕膜组织中主要分布在腺体细胞的细胞膜上。不明原因复发性流产患者β-catenin表达水平低于正常流产患者,差异有统计学意义(P<0.001)。2.复发性流产患者的绒毛和蜕膜组织中,Western结果显示β-catenin蛋白表达显著低于正常流产患者,差异有统计学意义(P<0.001),且绒毛及蜕膜组织中(3-catenin低表达的患者分别占全部20名患者的70%(P<0.001)及50%(P=0.0145)。3. URSA患者绒毛和蜕膜组织中,β-catenin mRNA的相对表达水平显著低于正常流产患者,差异有统计学意义(P<0.001),而DKK1 mRNA水平显著高于正常流产患者,差异有统计学意义(P<0.001)结论正常妊娠及不明原因复发性流产绒毛及蜕膜组织中均可检测到β-catenin及DKK1 mRNA,表明Wnnt信号途径在正常妊娠中起重要作用。β-catinin在正常早孕及不明原因复发性流产患者早孕绒毛的细胞滋养细胞膜和细胞核表达,表明Wnt信号途径参与了细胞滋养细胞的增殖过程。此外,在蜕膜组织的腺上皮表达也检测到β-catinin的表达,Writ信号途径可能参与蜕膜组织的腺体在早孕期绒毛滋养细胞入侵、胎盘形成及胎儿的生长过程。不明原因复发性流产患者的绒毛和蜕膜组织的β-catinin表达显著下调,而DKK1表达显著上调,表明Wnt信号通路在不明原因复发性流产患者是受抑制的,wnt/β-catinin表达下调可能是导致滋养细胞增殖及侵袭受抑制,从而导致早期流产。Wnt信号通路的异常表达可能参与不明原因复发性流产的过程。第二部分Wnt信号分子对滋养层细胞增殖迁移的机制研究研究背景作为Wnt信号通路最上游的因子,Wnt配体对信号通路的激活起到一个开关的作用。妊娠的不同时期绒毛滋养层细胞和子宫内膜(蜕膜)在增生期和分泌期基质和腺体细胞表达的Wnt配体也有所不同。10种Wnt配体及8种卷曲受体的在早孕胎盘组织中都有表达,但不同滋养细胞类型Wnt配体的表达有所不同,且随孕周的增加其表达也会发生改变。WNT1, WNT 7b, WNT 10a和 WNT 10b,从早孕期到晚孕期表达逐渐下降；WNT 1在细胞滋养细胞和绒毛外滋养细胞均大量表达,WNT 2、WNT 3在细胞滋养细胞和绒毛外滋养细胞均中量表达,而WNT 7b、WNT 9b在细胞滋养细胞大量表达,但在绒毛外滋养细胞表达显著下调。表明WNT 1、WNT 2、WNT 3对细胞滋养细胞的增生,绒毛外滋养细胞的分化和侵袭过程中起重要的作用。WNT 2、WNT 4、WNT 5a、WNT 7a、LRP6和β-catenin在子宫内膜的增生期和分泌期表达相当。wnt3在子宫内膜增生期表达显著高于分泌期。β-catenin在增生期和分泌期内膜的腺体和基质细胞均大量表达。此外,研究发现WNT 2, WNT 4, WNT 5a, WNT 7a, WNT 8b,和WNT 3,可通过月经周期的变化而调节,通过旁分泌的形式影响绒毛滋养细胞的功能。这些结果都表明Wnt/β-catenin及DKK1的表达在绒毛外滋养细胞的侵袭、迁移及胚胎植入过程中起重要作用。目的我们前期研究不明原因复发性流产患者Wnt信号通路是受抑制的。但是究竟哪些关键性的Wnt配体异常表达会影响不明原因复发性流产患者绒毛滋养层细胞的增殖能力和侵袭能力降低,目前还不是很清楚；本项目拟在前期工作的基础上,采用各种细胞生物学及分子生物学方法对不明原因复发性流产患者绒毛滋养层细胞差异Wnt配体进行筛选,揭示Wnt/β-catenin信号通路对人绒毛滋养细胞增生、迁移作用的分子学机制,从新的角度探索不明原因复发性流产的发病机制,为不明原因复发性流产的治疗筛选出高效的靶基因。方法取不明原因复发性流产及正常妊娠早孕绒毛及蜕膜组织各20例,本研究中选择的所有URSA患者连续发生自然流产的次数均超过2次,患者年龄在26-36岁。正常流产患者为同期非意愿早期妊娠,主动要求终止妊娠患者。用实时荧光定量PCR检测WNT1、WNT 2、WNT 2b, WNT3、WNT 3a, WNT4, WNT 9b, WNT 10A, WNT10B基因在不明原因复发性流产及正常孕妇妊娠早孕期绒毛及蜕膜组织中的表达变化,筛选差异表达的WNT基因,构建质粒,转染HTR-8/SVneo细胞,检测WNT配体对绒毛滋养细胞增殖、迁移能力的影响。结果1. WNT1、WNT 2b、WNT3a、WNT4、WNT 9b、WNT 10A、WNT 10B基因在不明原因复发性流产及正常妊娠绒毛及蜕膜组织的表达无显著性差异(P>0.05), WNT 2、WNT3在不明原因复发性流产蜕膜组织的表达显著降低(P<0.01),在不明原因复发性流产和正常妊娠绒毛组织的表达无显著差别(P>0.05)。2.用转染WNT2、WNT3蛋白体外培养HTR-8/SVneo细胞,细胞免疫荧光染色显示HTR-8/SVneo细胞中β-catenin能像细胞核转移并聚集,表明体外共培养WNT2、WNT3蛋白后,滋养层细胞内wnt/β-catenin信号通路能被激活。3. qPCR检测共培养WNT2组18h后细胞内MMP-2、MMP-9、Cyclin D mRNA相对表达倍数较对照组分别上调了2.42、2.187、1.81倍(P<0.05)；共培养WNT3组18h后细胞内MMP-2、MMP-9、Cyclin D mRNA相对表达倍数较对照组分别上调了1.975、2.31、2.25倍(P<0.05)；4. Western检测显示共培养WNT2组细胞内MMP-2、MMP-9、CylinD蛋白表达量较对照组组上调2.12、2.9、2.45倍(P<0.01)：共培养WNT3组细胞内MMP-2、MMP-9、CylinD蛋白表达量较对照组上调2.3、1.87、1.76倍(P<0.01)：5.MTT增殖试验显示,WNT2、WNT3体外培养HTR-8/SVneo细胞后,细胞的增殖能力显著增加。细胞划痕实验结果显示,与含有WNT2蛋白的条件培养基共培养18h后,滋养层细胞的迁移率为50%±3.1%,与含有WNT3蛋白的条件培养基共培养18h,细胞迁移距离为45%±2.89%,而与无WNT蛋白的培养基共培养18h后,迁移率为23%4±2.4%,两组细胞的迁移率与对照相比具有统计学意义(P<0.01)。结论不明原因复发性流产患者WNT 2、WNT3蜕膜组织的表达显著降低,我们从基因及蛋白水平证实体外共培养WNT2、WNT3蛋白后,滋养层细胞内wnt/p-catenin信号通路可被激活。细胞水平证实,WNT2、WNT3高表达显著提高HTR-8/SVneo细胞的增殖和迁移能力。因此我们推测可能是蜕膜组织WNT2、WNT3异常表达改变绒毛滋养层的微环境,抑制了绒毛滋养层细胞内Wnt信号通路的活性,从而使不明原因复发性流产患者绒毛滋养层细胞的增殖能力和迁移能力降低,导致流产的发生。