一、研究背景:蜱作为专性吸血节肢动物,可通过直接摄食行为和向宿主传播广泛的病毒、细菌和原生动物病原体,从而造成巨大的公共卫生负担。近年来,随着蜱媒疾病高效防治的需求急剧增加,蜱基因组学的快速发展,蜱细胞系的成功建立和基因编辑技术RNA干扰与CRISPR广泛应用于研究蜱基因功能,蜱媒病原体在蜱中定植、生长、免疫以及传播等方面的相互作用,已成为研究热点。目前,国外对于蜱虫-病原体互作的研究集中在莱姆病螺旋体（Borrelia burgdorferi）和嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）与蜱虫体内部分基因相互作用的研究,国内对于蜱虫相关基础性研究较少。立克次体属（Rickettsia）是一类G-严格胞内寄生菌,天然寄生于蜱、螨、蚤等节肢动物体内,叮咬宿主后,在叮咬处立克次体直接进入人体,引起地方性斑疹伤寒、流行性斑疹伤寒等人兽共患疾病。我们基于课题组已有的6大蜱属完整基因组数据,经过分析比对注释结果,发现各大蜱属内均带有立克次体,但不同蜱属携带立克次体丰度不同,同一蜱属携带立克次体阳性率也有差异,为继续研究其内在原因,同时考虑实验室培养细胞系为微小扇头蜱胚胎源细胞系,我们比较了不同微小扇头蜱种群基因型之间立克次体阳性率,筛选出一批与微小扇头蜱-立克次体互作有关的基因作为研究对象,通过RNA干扰技术敲低基因的表达,观察其对立克次体在微小扇头蜱细胞,肩突硬蜱细胞、人源细胞系内生长复制的影响。二、研究目的（1）建立生物信息学与实验室技术相结合的互作基因筛选方案与技术体系,用于致病性立克次体与蜱虫的互作基因库的建立;（2）建立多种蜱细胞与人源细胞系的体外RNAi干扰实验技术;（3）利用RNAi技术,鉴定一组与致病性立克次体生长复制相关的基因或基因家族。三、研究内容（1）将微小扇头蜱种群基因分型,同时分析不同种群间立克次体阳性率差异性。筛选出不同种群之间的与立克次体阳性率呈正相关的差异基因;通过微小扇头蜱细胞体外筛选劳氏立克次体互作基因,建立劳氏立克次体-微小扇头蜱细胞潜在互作基因库;（2）对上述互作基因设计dsRNA,通过RNAi敲低基因在mRNA水平表达,观察基因敲低后,立克次体在蜱细胞内生长复制情况,探讨其潜在相关性;（3）基于在微小扇头蜱细胞内的RNA干扰结果,研究其他蜱细胞与人源细胞筛选基因的RNA干扰对立克次体生长的影响。四、研究方法（1）对实验室已有微小扇头蜱基因组进行种群基因分型,经过不同种群之间立克次体阳性率比较后,筛选差异基因,建立立克次体-微小扇头蜱互作基因备选库。将劳氏立克次体（R.raoultii）感染微小扇头蜱细胞,通过实时荧光定量PCR分析不同时间点备选基因的表达量,筛选出具有统计学差异的基因建立劳氏立克次体-微小扇头蜱细胞潜在互作基因库。（2）对互作基因库内基因设计dsRNA,通过转染试剂将dsRNA转入微小扇头蜱细胞内,观察其对细胞内目的基因的敲低效果;对可以成功敲低的基因,R.raoultii感染细胞后,将dsRNA转染进细胞,观察微小扇头蜱细胞备选基因RNAi后对R.raoultii生长复制的影响。（3）参考微小扇头蜱细胞内的实验结果,利用NCBI中基因组数据,寻找人与肩突硬蜱与微小扇头蜱的同源基因序列,主要是钙网蛋白（Calreticulin）与组蛋白（Histone）基因,设计dsRNA/si RNA,将目的基因成功敲低后,研究其他蜱细胞与人源细胞筛选基因的RNAi对立克次体生长的影响。五、研究结果（1）筛选并建立劳氏立克次体-微小扇头蜱细胞潜在互作基因库。通过微小扇头蜱种群基因分型,我们将微小扇头蜱样本分为三个种群基因型,经过立克次体阳性率差异分析后,筛选出99条基因与立克次感染呈正相关基因;经过蜱细胞的转录组二代测序数据与微小扇头蜱样本基因组RNA Seq数据进行比对,得到同时在微小扇头蜱细胞基因组与微小扇头蜱成蜱基因组同时表达的46条基因序列;经过微小扇头蜱细胞体外筛选,共有28条微小扇头蜱基因序列分别在微小扇头蜱细胞感染立克次体后,在不同时间点表达量增高,具有统计学意义（P＜0.05）,建立劳氏立克次体-微小扇头蜱细胞潜在互作基因备选库。（2）RNAi后观察降低R.raoultii在CTVM23细胞内复制生长。经过网站设计,共合成17对dsRNA。通过转染试剂将dsRNA转染进微小扇头蜱细胞后,可以敲低10对dsRNA对应的mRNA表达量,具有统计学意义（P＜0.05）。将R.raoultii感染微小扇头蜱细胞,并在12 h后,将dsRNA转染进蜱细胞内,用q RTPCR方法,测得转染后各目的基因表达水平和R.raoultii在细胞内生长复制的变化,实验结果表明:6条备选微小扇头蜱细胞基因有效降低R.raoultii在蜱细胞内的生长复制,具有统计学差异（P＜0.05）。（3）肩突硬蜱细胞与人单核巨噬细胞同源基因降低立克次体在细胞内的生长复制。将上述影响微小扇头蜱细胞内立克次体生长复制的基因通过NCBI找到肩突硬蜱和人的同源序列,结果发现Calreticulin与Histone与微小扇头蜱有同源序列,以这两条序列为基础设计dsRNA/si RNA,经过实验证明,上述基因的dsRNA/si RNA有效敲低肩突硬蜱细胞和人单核巨噬细胞的内源性目的基因mRNA表达水平,具有统计学意义（P＜0.05）;同理,将立克次体感染肩突硬蜱细胞和人单核巨噬细胞以观察上述基因对立克次体的影响。实验结果证明分别在在人单核巨噬细胞与肩突硬蜱细胞中敲低Calreticulin与Histone基因的mRNA水平表达后,降低立克次体在细胞内的复制水平,具有统计学差异（P＜0.05）。六、研究结论（1）经过微小扇头蜱大规模基因组筛选,并比较不同种群间立克次体阳性率差异,共筛选得到99条基因,经过蜱细胞与微小扇头蜱样本基因组二代转录组比对,得到同时在微小扇头蜱细胞基因组与微小扇头蜱成蜱基因组同时表达的46条基因,经过体外实验筛选,27条基因在微小扇头蜱细胞感染劳氏立克次体之后,mRNA水平表达量显著增加,作为劳氏立克次体-微小扇头蜱细胞潜在互作基因备选库。（2）针对微小扇头蜱基因序列设计的17对dsRNA中,有10对能够显著降低微小扇头蜱内源性基因在mRNA水平的表达,另外其中6对dsRNA在敲低微小扇头蜱基因的表达水平之后,影响了R.raoultii在微小扇头蜱细胞内的生长复制。（3）敲低Calreticulin与Histone基因的mRNA水平表达后,不仅影响微小扇头蜱中细胞中立克次体复制,同时也降低了立克次体在肩突硬蜱细胞与人单核细胞中的增殖。表明Calreticulin与Histone基因在蜱虫-立克次体-宿主互作过程中发挥出较大作用,值的进一步探究。七、创新点1、本项研究基于课题组长期工作得到的微小扇头蜱宏基因组数据和假设,发现微小扇头蜱不同种群基因型携带立克次体阳性率不同,通过生信分析与体外实验的结合,进行大规模致病性立克次体-微小扇头蜱互作基因的筛选,并建立劳氏立克次体-微小扇头蜱细胞潜在互作基因备选库;2、本项研究成功设计针对微小扇头蜱细胞基因的特异性双链RNA（dsRNA）,其中10对dsRNA有效敲低其内源性目的基因的mRNA水平表达;3、基于微小扇头蜱不同种群基因型携带立克次体丰度不同这一结论,筛选出6条基因影响立克次体在微小扇头蜱细胞生长复制的基因,目前尚无文献报道这6条基因与立克次体的互作关系,亟需后续进一步搞清他们与立克次体具体的互作机制。4、根据人、肩突硬蜱与微小扇头蜱的同源性序列,进一步探索出Histone基因不仅在微小扇头蜱细胞系中影响立克次体复制,同时在肩突硬蜱细胞和人巨噬细胞系中也有相同作用。Calreticulin虽然在微小扇头蜱细胞系中未影响立克次体的复制,却在肩突硬蜱细胞和人巨噬细胞细胞中降低了立克次体的复制水平。