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紧密连接（tight junction,TJ）位于细胞连接的最顶端,由跨膜蛋白和胞质肌动蛋白组成。跨膜蛋白包括Claudins（CLDNs）、Occludins（OCLDs）和连接黏附分子（junctional adhesion molecules,JAMs）。其中,CLDNs 是重要的紧密连接蛋白,具有屏障和栅栏功能。作为CLDNs家族成员之一,CLDN6是课题组前期克隆和鉴定的候选乳腺癌抑制基因。目前认为,CLDN6的异常表达参与乳腺癌等多种肿瘤的生长、转移及耐药等过程。前期工作中我们发现,CLDN6在乳腺癌中低表达,过表达CLDN6明显抑制乳腺癌生长,但其机制尚不清楚。为了满足快速生长的需求,肿瘤细胞以有氧糖酵解作为主要的葡萄糖代谢途径,用于快速提供能量及合成代谢所需中间产物。前期代谢组学分析发现,过表达CLDN6的MDA-MB-231细胞中乳酸含量发生改变,提示CLDN6可能调控乳腺癌细胞有氧糖酵解过程。在肿瘤细胞增殖过程中,有氧糖酵解的增加主要与糖酵解转运蛋白或相关酶的异常增加或激活有关。转录因子c-MYC是参与细胞增殖和代谢等过程的原癌基因MYC产物之一,通过促进葡萄糖转运体1（glucose transporter 1,GLUT1）和乳酸脱氢酶 A（lactate dehydrogenase A,LDHA）等靶基因转录,调控肿瘤细胞有氧糖酵解。前期RNAseq筛查发现,过表达CLDN6的MCF-7细胞中c-MYC明显下调。由此推测,CLDN6可能通过c-MYC介导的有氧糖酵解抑制乳腺癌生长,但其相关分子机制需本课题进行进一步研究。CLDN6依赖信号传导功能参与对肿瘤发生发展过程的调控。一方面,CLDN6的羧基末端含有PDZ结合基序,可以与含有PDZ结构域的蛋白相互作用,参与细胞的信号传导;另一方面,CLDN6依赖其第2个胞外环（the extracellular loop 2,ECL2）和 Tyr196/200 结合并激活 Src 家族激酶（Src-family kinases,SFK）,调控SFK相关信号通路。新近研究发现,CLDNs等紧密连接相关蛋白通过与YAP/TAZ结合,调控其表达和定位。细胞质定位的YAP/TAZ通过蛋白酶体途径降解,细胞核定位的YAP/TAZ与转录增强关联域（transcriptional enhanced associate domain,TEAD）转录因子结合,促进其转录活性,而c-MYC是TEAD的靶基因。TCGA数据库分析显示,CLDN6的mRNA表达与TAZ的蛋白表达呈负相关。由于TAZ含有PDZ结合基序,我们猜测,CLDN6和TAZ可能通过与含有PDZ结构域的蛋白结合,使TAZ滞留在细胞质中,入核减少,进而调控c-MYC介导的有氧糖酵解,抑制乳腺癌生长。本论文旨在探讨CLDN6通过c-MYC介导的有氧糖酵解抑制乳腺癌生长的作用及机制,为CLDN6作为乳腺癌诊断和预后的生物学标记提供理论和实验依据。方法:以课题组前期构建的过表达CLDN6的MCF-7和MDA-MB-231细胞（分别记为MCF-7/CLDN6和MDA-MB-231/CLDN6细胞）为研究对象,进行如下研究:1.CLDN6对乳腺癌细胞增殖及有氧糖酵解的影响（1）CLDN6对乳腺癌细胞增殖的影响:EdU细胞增殖实验检测DNA复制能力;CCK8实验检测细胞活力;平板克隆形成实验检测克隆形成能力。（2）CLDN6对乳腺癌细胞有氧糖酵解的影响:①MDA-MB-231/CLDN6细胞的代谢组学分析:利用UHPLC-QTOFMS平台进行代谢组学检测（正离子和负离子模式）,对代谢物进行主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA）;差异代谢物以火山图呈现并进行层次聚类分析和KEGG分析。②CLDN6在乳腺癌细胞有氧糖酵解中的作用:葡萄糖、乳酸和ATP检测试剂盒分别检测葡萄糖摄入量、乳酸产生量和ATP含量;Seahorse细胞能量代谢分析仪检测ECAR,并计算糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。2.CLDN6通过c-MYC介导的有氧糖酵解抑制乳腺癌细胞增殖的机制（1）CLDN6对c-MYC及其靶基因GLUT1和LDHA表达的影响:RT-PCR和Western blot分别检测c-MYC、GLUT1和LDHA的mRNA和蛋白表达。（2）c-MYC在CLDN6抑制乳腺癌细胞有氧糖酵解和增殖中的作用:① MCF-7/CLDN6-c-MYC 和 MDA-MB-231/CLDN6-c-MYC 细胞系的构建与鉴定:利用慢病毒转染法在MCF-7/CLDN6和MDA-MB-231/CLDN6细胞中稳定过表达 c-MYC,分别记为 MCF-7/CLDN6-c-MYC和 MDA-MB-231/CLDN6-c-MYC细胞,荧光显微镜观察慢病毒感染效率;RT-PCR和Western blot分别检测c-MYC的mRNA和蛋白表达,以鉴定转染效率。（2）c-MYC在CLDN6抑制乳腺癌细胞增殖中的作用:EdU细胞增殖实验、CCK8实验和平板克隆形成实验分别检测DNA复制能力、细胞活力和克隆形成能力。（3）c-MYC在CLDN6抑制乳腺癌细胞有氧糖酵解中的作用:RT-PCR和Western blot分别检测GLUT1和LDHA的mRNA和蛋白表达;葡萄糖、乳酸和ATP检测试剂盒分别检测葡萄糖摄入量、乳酸产生量和ATP含量。（4）c-MYC介导的有氧糖酵解在CLDN6抑制乳腺癌细胞增殖中的作用:用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-Deoxyglucose,2-DG）处理MCF-7/CLDN6-c-MYC 和 MDA-MB-231/CLDN6-c-MYC 细胞,采用 EdU 细胞增殖实验、CCK8实验和平板克隆形成实验分别检测DNA复制能力、细胞活力和克隆形成能力。（3）CLDN6调控c-MYC的机制:① CLDN6对TAZ表达及亚细胞定位的影响:Western blot检测TAZ和YAP蛋白表达;IF检测TAZ表达和亚细胞定位。（2）CLDN6与TAZ结合:IF检测CLDN6与TAZ共定位;Co-IP检测CLDN6与TAZ的相互结合;利用慢病毒转染法在MCF-7和MDA-MB-231细胞中稳定过表达PDZ结合基序缺失的CLDN6突变体（CLDN6△PBM）,分别记为 MCF-7/CLDN6△PBM和 MDA-MB-231/CLDN6△PBM细胞;Western blot检测CLDN6△PBM蛋白表达;IF检测CLDN6△PBM表达及亚细胞定位;Co-IP检测CLDN6△PBM与TAZ的相互结合。3.体内研究CLDN6通过c-MYC对乳腺癌生长的抑制作用（1）体内实验检测CLDN6对乳腺癌生长的影响:10只雌性BALB/cA-nu小鼠分为以下2组:MDA-MB-231/Vec组和MDA-MB-231/CLDN6组,皮下注射乳腺癌细胞悬液建立裸鼠异种移植瘤模型。测量并计算移植瘤体积,称量移植瘤重量;HE染色观察移植瘤组织形态;IHC检测移植瘤组织中Ki67表达并计算细胞增殖指数;IHC检测移植瘤组织中CLDN6、c-MYC、GLUT 1和LDHA表达。（2）体内实验检测c-MYC在CLDN6抑制乳腺癌生长中的作用:10只雌性 BALB/cA-nu 小鼠分为以下 2 组:MDA-MB-231/CLDN6-Vec 组和 MDA-MB-231/CLDN6-c-MYC组,皮下注射乳腺癌细胞悬液建立裸鼠异种移植瘤模型。测量并计算移植瘤体积,称量移植瘤重量;HE染色观察移植瘤组织形态;IHC检测移植瘤组织中Ki67表达并计算细胞增殖指数;IHC检测移植瘤组织中c-MYC、GLUT1和LDHA 表达。4.人乳腺癌组织中CLDN6、TAZ及c-MYC的表达及其临床意义（1）人乳腺癌组织中CLDN6、TAZ及c-MYC的表达及其与临床病理参数的关系:IHC检测人乳腺癌组织芯片中CLDN6、TAZ及c-MYC的表达,并分析三者间的相关性及其与临床病理参数的关系。（2）人乳腺癌组织中CLDN6、TAZ及c-MYC的表达与患者预后的关系:Kaplan-Meier plotter数据库评估CLDN6表达量、CLDN6与TAZ表达量比值及CLDN6与c-MYC表达量比值与乳腺癌患者总生存期（overall survival,OS）和无复发生存期（relapse-free survival,RFS）的关系,预测 CLDN6、TAZ 及 c-MYC与乳腺癌患者预后的关系。结果:1.CLDN6对乳腺癌细胞增殖及有氧糖酵解的影响（1）CLDN6对乳腺癌细胞增殖的影响:与空载组相比,MCF-7/CLDN6和MDA-MB-231/CLDN6组细胞DNA复制能力、细胞活力和克隆形成能力明显下降。以上结果表明,CLDN6抑制乳腺癌细胞增殖。（2）CLDN6对乳腺癌细胞有氧糖酵解的影响:①MDA-MB-231/CLDN6细胞的代谢组学分析:与空载组相比,在正离子模式下,MDA-MB-231/CLDN6组有9个代谢物明显增加,29个代谢物明显减少;在负离子模式下,MDA-MB-231/CLDN6组有22个代谢物明显增加,23个代谢物明显减少,其中包括乳酸。MDA-MB-231/CLDN6组细胞嘌呤代谢、嘧啶代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、脂肪酸生物合成代谢和磷酸戊糖途径发生明显改变。以上结果表明,CLDN6改变乳腺癌细胞代谢模式,其中细胞内乳酸含量发生变化,可能参与调控乳腺癌细胞有氧糖酵解。（2）CLDN6在乳腺癌细胞有氧糖酵解中的作用:与空载组相比,MCF-7/CLDN6和MDA-MB-231/CLDN6组细胞葡萄糖摄入量、乳酸产生量和ATP含量明显减少;MCF-7/CLDN6和MDA-MB-231/CLDN6组细胞糖酵解和糖酵解能力均明显下降;MCF-7/CLDN6组细胞糖酵解储备明显下降,MDA-MB-231/CLDN6组细胞糖酵解储备有下降趋势,但差异无显著性。以上结果表明,CLDN6抑制乳腺癌细胞有氧糖酵解。2.CLDN6通过c-MYC介导的有氧糖酵解抑制乳腺癌细胞增殖的机制（1）CLDN6对c-MYC及其靶基因GLUT1和LDHA表达的影响:与空载组相比,MCF-7/CLDN6 和 MDA-MB-231/CLDN6 组细胞中,c-MYC、GLUT1和LDHA的mRNA和蛋白表达明显减少。以上结果表明,CLDN6对c-MYC及其靶基因GLUT1和LDHA的表达具有抑制作用。（2）c-MYC在CLDN6抑制乳腺癌细胞增殖和有氧糖酵解中的作用:① MCF-7/CLDN6-c-MYC 和 MDA-MB-231/CLDN6-c-MYC 细胞系的构建与鉴定:慢病毒感染效率在90%以上;与空载组相比,MCF-7/CLDN6-c-MYC和MDA-MB-231/CLDN6-c-MYC组细胞c-MYC的mRNA和蛋白表达明显增加。以上结果表明,成功构建 MCF-7/CLDN6-c-MYC 和 MDA-MB-231/CLDN6-c-MYC细胞系。（2）c-MYC在CLDN6抑制乳腺癌细胞增殖中的作用:与空载组相比,MCF-7/CLDN6-c-MYC 和 MDA-MB-231/CLDN6-c-MYC 组细胞 DNA 复制能力、细胞活力和克隆形成能力明显增加。以上结果表明,CLDN6依赖c-MYC抑制乳腺癌细胞增殖。（3）c-MYC在CLDN6抑制乳腺癌细胞有氧糖酵解中的作用:与空载组相比,MCF-7/CLDN6-c-MYC 和 MDA-MB-231/CLDN6-c-MYC 组细胞 GLUT1 和LDHA的mRNA和蛋白表达明显增加;葡萄糖摄入量和乳酸产生量明显增加,但ATP含量明显减少,这可能与过表达c-MYC后细胞增殖改变引起ATP的消耗有关。以上结果表明,CLDN6依赖c-MYC抑制乳腺癌细胞有氧糖酵解。（4）c-MYC介导的有氧糖酵解在CLDN6抑制乳腺癌细胞增殖中的作用:与对照组相比,2-DG处理组细胞DNA复制能力、细胞活力和克隆形成能力明显下降。以上结果表明,CLDN6依赖c-MYC介导的有氧糖酵解抑制乳腺癌细胞增殖。（3）CLDN6调控c-MYC的机制:① CLDN6对TAZ表达及亚细胞定位的影响:与空载组相比,MCF-7/CLDN6和MDA-MB-231/CLDN6组细胞TAZ蛋白表达明显减少,其同源物YAP表达无明显改变;TAZ细胞质定位增加而细胞核定位减少。以上结果表明,CLDN6抑制TAZ的表达及核易位。（2）CLDN6与TAZ结合:MCF-7/CLDN6细胞中,CLDN6与TAZ在细胞质中存在共定位;MDA-MB-231/CLDN6细胞中,CLDN6和TAZ在细胞质和细胞膜中存在共定位;CLDN6与TAZ相互结合;与空载组相比,MCF-7/CLDN6△PBM 和 MDA-MB-231/CLDN6△PBM 组细胞 CLDN6△PBM 蛋白水平明显增加,且CLDN6△PBM位于细胞膜和细胞质;CLDN6△PBM与TAZ相互结合。以上结果表明,CLDN6不依赖PDZ结合基序与TAZ结合。3.体内研究CLDN6通过c-MYC对乳腺癌生长的抑制作用（1）体内实验检测CLDN6对乳腺癌生长的影响:与空载组相比,MDA-MB-231/CLDN6组细胞形成的肿瘤体积和重量明显减少;移植瘤组织细胞较小,细胞核体积较小,染色较浅,核分裂象较少;移植瘤组织中Ki67阳性细胞数明显减少。移植瘤组织中,CLDN6主要表达在细胞膜,c-MYC主要表达在细胞核,GLUT1主要表达在细胞膜,LDHA主要表达在细胞质,均呈棕黄色染色。MDA-MB-231/CLDN6组细胞形成的移植瘤组织中,CLDN6表达明显增加,c-MYC、GLUT1和LDHA表达明显减少。以上结果表明,CLDN6抑制裸鼠体内乳腺癌生长和移植瘤组织中c-MYC及其靶基因的表达。（2）体内实验检测c-MYC在CLDN6抑制乳腺癌生长中的作用:与空载组相比,MDA-MB-231/CLDN6-c-MYC组细胞形成的肿瘤体积和重量明显增加;移植瘤细胞异型性明显,细胞核染色加深,核分裂象增加,血管增多;移植瘤组织中Ki67阳性细胞数明显增加;c-MYC、GLUT1和LDHA表达明显增加。以上结果表明,CLDN6通过c-MYC抑制裸鼠体内乳腺癌生长,可能与有氧糖酵解有关。4.人乳腺癌组织中CLDN6、TAZ及c-MYC的表达及其临床意义（1）人乳腺癌组织中CLDN6、TAZ及c-MYC的表达及其与病理参数的关系:人乳腺癌组织中,CLDN6主要表达在细胞膜,TAZ和c-MYC主要表达在细胞核,均呈棕黄色染色;乳腺癌组织中CLDN6与TAZ、c-MYC呈负相关,但差异无显著性,c-MYC与TAZ呈显著正相关;c-MYC高表达的乳腺癌患者易发生淋巴结转移,CLDN6和TAZ的表达与患者病理参数之间没有显著关系。（2）人乳腺癌组织中CLDN6、TAZ及c-MYC的表达与患者预后的关系:CLDN6高表达、CLDN6与TAZ表达量比值高及CLDN6与c-MYC表达量比值高的乳腺癌患者OS和RFS较长,即CLDN6高表达,TAZ和c-MYC低表达的乳腺癌患者预后较好。结论:1.CLDN6可能通过TAZ调控c-MYC介导的有氧糖酵解,进而抑制乳腺癌生长。2.CLDN6高表达,TAZ和c-MYC低表达的乳腺癌患者预后较好。