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研究背景蒙医传统药材白益母草为唇形科脓疮草属植物脓疮草的地上部分,至今仍在蒙古地区广泛使用。现有文献关于其本草考证、植物分类和生药鉴定方面已有较为详尽的报道,化学组分和蒙医临床运用方面也有少量研究,而药效学研究几乎为空白。因此,开展对白益母草的药效研究具有指导临床应用、为疾病治疗提供新思路、开发新药用等现实意义。血管功能和结构的异常能够引起机体广泛的病理变化,是引发心脑血管疾病的主要原因之一。血管增生性疾病(Vascular proliferative diseases)系指以血管内膜异常增生为外在表现的血管堵塞性疾病。血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)作为血管壁的主要组成细胞,其表型转化是血管增生性疾病的主要细胞病理基础。目前,通过研究VSMC表型转化进而探讨血管增生性疾病的发病机制越来越受到关注。研究目的蒙古族医药是民族医药理论体系的重要组成之一,对疗效确切的蒙药开展物质基础和作用机制研究是对蒙医药理论体系的重要补充。本论文在前期研究基础上选取白益母草活性成分生物碱作为研究对象,以新生内膜热点药靶NADPH氧化酶的亚型激活为切入点,围绕VSMC表型转化的调控,探讨其对血管增生性疾病中VSMC的调控机制,阐释以活血化瘀、利尿除浊为治则的蒙医药理论的科学内涵,填补白益母草药效学研究空白。研究方法1.白益母草总生物碱提取物小鼠口服急性毒性实验:白益母草生药材加适量709%乙醇使用加热回流法提取,所得提取液浓缩,冻干;60%乙醇溶解,经SP825树脂富集,水洗,浓缩,冻干,得总生物碱提取物;昆明种小鼠,雌雄各半,按体重随机分为空白组和给药组,给药组灌胃给予白益母草总生物碱提取物的最大溶解度溶液,一天内两次,间隔8h,折合生药量总给药量为1332g·kg-1·d-1,空白组灌胃给予等体积蒸馏水;给药后正常饲养,连续观察小鼠的一般生存和死亡情况14天。2.白益母草生物碱对小鼠机械损伤复合脂多糖致内膜增生模型的作用研究:雄性C57BL/6J小鼠按体重随机分为假手术组、模型组和给药组(水苏碱低/高剂量组,白益母草总生物碱低/高剂量组,阳性对照药辛伐他汀组和阿司匹林组);模型组和给药组行机械损伤股动脉手术,腹腔注射给予脂多糖7天以增强炎症反应;同时给药21天,实验期间每3天记录一次体重;于第22天摘眼采血,分离得血清,检测CRP含量;处死后剥离手术段股动脉、行常规石蜡切片HE染色观察血管组织形态变化。3.水苏碱对PDGF-BB诱导VSMC增殖模型的作用机制研究:原代培养大鼠胸主动脉VSMC,经骨架蛋白SM α-actin荧光标记鉴定;通过量-效和时-效实验确定PDGF-BB诱导增殖的最佳条件;水苏碱及各阳性药对正常VSMC的毒性检测;水苏碱及各阳性药对PDGF-BB诱导的半数抑制浓度检测;给药后于倒置相差/荧光显微镜下观察细胞形态和骨架变化,Western Blot法检测NADPH亚型蛋白NOX1、VSMC收缩功能相关蛋白SM α-actin和SMMHC、VSMC合成型相关蛋白VCAM-1的表达水平。研究结果1.由白益母草总生物碱急毒实验结果可知,其在最大给药量,按生药量计为1332g·kg-1·d-1(总生物碱量为103.8g·kg-1·d-1)下对小鼠无急性毒性作用,且该剂量是实验用量按生药计4.79g·kg-1·d-1(总生物碱量最高为0.67 g.kg-1.d-1)的278倍(总生物碱为155倍)。确定白益母草总生物碱最大耐受剂量>1332g·kg-1.d-1。2.小鼠机械损伤复合脂多糖致内膜增生实验终点时,模型组小鼠体重仍未恢复至实验前水平,阿司匹林组体重超出实验前水平,余下各组均恢复至实验前体重;血管组织形态观察显示水苏碱以及各阳性对照药对机械损伤引起的小鼠内膜增生均有一定的抑制作用;血清CRP的检测结果显示实验终点时各组间均无显著性差异。3.PDGF-BB诱导实验显示PDGF-BB以40ng/mL的浓度刺激VSMC24h后对诱导增殖的效应最强;水苏碱在6mM～0.1 mM浓度范围内对正常培养VSMC无细胞毒性,但对PDGF-BB诱导增殖有一定抑制作用,其IC50为0.2 mM;Western Blot结果显示水苏碱对PDGF-BB的诱导效应:一方面,能够显著性抑制NOX-1(P<0.01)和合成型相关蛋白VCAM-1的高表达(P<0.001);另一方面,能够阻止收缩型相关蛋白SM α-actin的降低。研究结论1.动物实验结果显示,本实验所用白益母草总生物碱浓度在安全给药范围内;白益母草总生物碱和水苏碱对机械损伤复合脂多糖诱导所致内膜增生有抑制作用,推测水苏碱为白益母草总生物碱内抗血管内膜增生发挥保护作用的主要活性成分。2.细胞实验结果显示,水苏碱能够阻止VSMC由收缩型向合成型的转化,推测其可能机制为抑制NOX-1介导的表型转化调控,从而阻止骨架蛋白SMα-actin的丢失,抑制合成型相关蛋白VCAM-1的表达,保护受损血管的正常结构和功能。