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研究背景和目的:自噬作为广泛存在于真核细胞中的生命现象,是细胞成分更新、发育、分化的重要调控机制,对维持蛋白代谢平衡及细胞内环境稳定具有重要意义。自噬是目前细胞生物学研究的热点之一,自噬与肿瘤关系的研究更被广泛关注。1999年Beth Levine等发现Beclin1单等位基因缺失致乳腺癌等患病率升高,人们认为自噬与肿瘤发生相关,并探寻诱导自噬治疗肿瘤。但进一步研究发现,自噬具有两面性,某些情况下,诱导自噬可以抑制肿瘤生长,并致自噬相关性细胞死亡;但更多情况下,肿瘤细胞可利用自噬以应对缺氧、营养匮乏及清除氧自由基、损伤的线粒体等,从而保护瘤细胞。值得注意的是:自噬对肿瘤的影响具有细胞类型及剌激依赖性,在不同的肿瘤类型与剌激条件下,自噬所起作用可能不同。多发性骨髓瘤(MM)细胞因分泌大量免疫球蛋白,蛋白质代谢极为旺盛,而自噬作为蛋白质降解代谢主要途径之一,对MM细胞死亡过程中究竟起着什么样的作用,目前尚无前人的经验可循。本课题以MM细胞系RPMI8226、H929及原代细胞为研究材料,探寻自噬对阿霉素(DOX)等化疗药物的促MM细胞凋亡的活性及其相关机制。方法和结果: 1.MTT法首先探寻自噬抑制剂羟氯喹(HCQ)或自噬激活剂雷帕霉素(RAPA)单药对RPMI8226及H929细胞的影响,以明确其剂量-效应关系;结果表明羟氯喹能够抑制两种细胞的增殖,并呈浓度依赖性,而雷帕霉素对细胞增殖基本无影响。2.流式细胞术发现,亚细胞毒剂量的自噬抑制剂羟氯喹、3-methlyadenine (3-MA)、Bafilomycin A1(BAF),与阿霉素、顺铂(DDP)、米托蒽醌(MIT)、马法兰(MEL)等合用均可产生增敏作用,与单药相比差异显著(P<0.05);而与长春新碱(VCR)、Bortezomib(BOR)、足叶乙甙(VP-16)等联用则无效(P>0.05)。3.透射电镜证实: 3MA单药处理组及未处理组自噬泡少见,羟氯喹+阿霉素、BAF+阿霉素组及雷帕霉素阳性对照组可见到大量自噬泡,羟氯喹、BAF及阿霉素单用组可见中等量自噬泡出现,3-MA+阿霉素联用组仅见少量自噬泡。4.内源性LC3免疫荧光染色显示,羟氯喹+阿霉素、BAF+阿霉素及雷帕霉素处理组MM细胞胞浆可见大量颗粒状荧光,羟氯喹、BAF、阿霉素单用组仅有中等量颗粒状荧光,而3-MA及3-MA+阿霉素组胞浆荧光信号基本呈弥散分布,类似于未处理对照组。5. Western blot证实:①阿霉素单药处理RPMI8226及H929细胞后8、12、24、36h,自噬蛋白Beclin1、Atg5、LC3-II表达渐升高,说明阿霉素诱导自噬活化;②Beclin1、Atg5、LC3-II表达分析表明,自噬抑制剂3-MA、羟氯喹及BAF的化学增敏作用分别与其对MM细胞自噬反应的早期抑制(阻断自噬体膜形成)与晚期抑制(抑制自噬体与溶酶体融合)有关。③凋亡蛋白caspase-3及PARP检测表明,自噬抑制剂与阿霉素联用凋亡蛋白表达高于单用阿霉素组。5. siRNA技术证明:特异性Beclin1及Atg5 siRNA导入RPMI8226及H929细胞致Beclin1及Atg5沉默,亦可增加阿霉素诱导的MM凋亡。6.小鼠模型证明:体内环境下,抑制自噬亦可增加阿霉素抑MM效应。结论:1.阿霉素能够诱导MM凋亡同时诱发自噬反应,自噬是瘤细胞应对DNA损伤应激的一种保护性反应;2.化学抑制剂及siRNA抑制自噬,均可增加阿霉素诱导的MM系及原代MM细胞凋亡;3.体内动物模型下,抑制自噬亦可增加阿霉素抑MM效应。