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α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是一种糖苷水解酶,它能够特异性水解非还原性末端的鼠李糖基。目前α-L-鼠李糖苷酶广泛地应用于食品、制药、化工等行业,市场前景广阔。微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶一般都需要诱导物的诱导来促进产酶,但同时还伴随有β-葡萄糖苷酶产生,混合酶不仅存在纯化困难的问题还对后续应用造成不便。因此,得到单一并且催化效率高的α-L-鼠李糖苷酶就显得十分必要。本课题组前期分离得到一株黑曲霉菌株NCU-317,在进行诱导产α-L-鼠李糖苷酶的同时也有β-葡萄糖苷酶的产生。因此本研究拟通过现代分子生物学技术构建工程菌的方法来解决上述存在的问题。本论文主要结果如下:1、通过改变文献广泛报道的液体摇瓶为固体平板培养方法,提取到了完整的总RNA,随后采用改进的RACE技术并结合设计了特异性的接头引物,并充分运用了TdT末端转移酶的性质,还运用了Nested PCR、Touch-down PCR来提高RACE技术的稳定性和可靠性。经过实验发现此改良后的RACE法应用于黑曲霉中α-L-鼠李糖苷酶基因调取效果良好。2、以前期得到的黑曲霉NCU-317 cDNA为模板,通过普通PCR成功获得了α-L-鼠李糖苷酶基因(α-L-Rha)全长。α-L-鼠李糖苷酶基因全长3018bp,其中含有2748bp的完整开放阅读框,5’非编码区长为216bp,3’非编码区长为72bp。经过对序列的生物信息学分析显示:编码蛋白由915个氨基酸组成,预测理论分子量为103.94kD,等电点为5.59;蛋白质二级结构以无规则卷曲为主;将氨基酸序列输入UniProt比对后发现,黑曲霉NCU-317的产酶序列与细菌家族中的α-L-鼠李糖苷酶家族蛋白同源性最高,达到了99.6%。3、构建原核重组表达载体pET25b-α-L-Rha,采用能够识别稀有密码子的Rossetta为宿主菌。经过IPTG诱导实验,确定原核表达载体分泌的α-L-鼠李糖苷酶为包涵体形式,包涵体经稀释透析复性法后以芦丁和柚皮苷为底物进行去鼠李糖基活性测定,HPLC法几乎检测不到重组α-L-鼠李糖苷酶活性。4、构建了pPIC9K-α-L-Rha重组载体,毕赤酵母GS115为宿主菌。用Bgl II对重组载体线性化后电转入毕赤酵母GS115,筛选到8株符合Bgl II线性化表型的转化子,分别诱导后,但是几乎测不到有α-L-鼠李糖苷酶酶活出现。随后将8株阳性毕赤酵母工程菌诱导120 h后,对上清专门进行了70%的硫酸铵沉淀和透析操作,最终几乎检测不到酶活。5、随后将黑曲霉NCU-317中原始基因和来源于JMU-TS528的原始产酶序列分别优化后,在优化的JMU-TS528基因工程菌中检测到了酶活,其酶活在45℃达到了626.21 U/mL。