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目的
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma, MM)是目前血液系统第二大恶性肿瘤。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib, BTZ)是临床上治疗MM的经典药物，但其有限的疗效、继发性耐药及产生的毒副作用等均在一定程度上限制了其在临床上的应用。作为一种廉价、广谱、抗癌效果强且毒副作用小的中药提取物，新藤黄酸(Gambogenic acid, GNA)展现了广阔的抗癌前景。在本研究中，我们拟探讨GNA联合BTZ诱导MM凋亡的相关机制。
方法
用不同浓度的BTZ和GNA处理骨髓瘤细胞株MM.1S和RPMI8226，显微镜下观察细胞形态学上的改变，采用CCK-8法分别检测两种药物对MM.1S和RPMI8226细胞的增殖抑制作用，并结合增殖抑制结果对两组细胞株的基因组及转录组学数据进行分析；采用流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测BTZ、GNA单药或联合在不同浓度的作用下对MM.1S细胞的周期阻滞；Westernblot法检测PARP、p53、Caspase-3、Bax及Bcl-2凋亡相关蛋白的表达水平；建立裸鼠荷瘤模型，取1×107个MM.1S骨髓瘤细胞接种于裸鼠，待裸鼠肿瘤的平均体积达100～250mm3后随机分成4组，分别使用BTZ(0.25 mg/kg/d 1、4、8、11)、GNA(2.0mg/kg，隔天)、BTZ联合GNA(BTZ0.25mg/kg/d1、4、8、11及GNA2.0mg/kg隔天)以及等时等量的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)进行干预，用于评价药物对MM.1S荷瘤鼠的抗肿瘤作用；TUNEL法检测荷瘤组织细胞的凋亡；免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)及Westernblot法检测移植瘤组织细胞生长及凋亡相关蛋白Ki-67、PARP、p53、Caspase-3、Bax及Bcl-2的表达；活性氧(Reactive oxygen species, ROS)试剂盒检测BTZ、GNA单药及两药协同作用于MM.1S细胞后ROS的变化；Westernblot检测在药物作用后p38MAPK及p-p38MAPK蛋白的表达情况；AnnexinV-PI双染结合FCM的方法检测ROS抑制剂N-乙酰基半胱氨酸(N-acetyl cysteine, NAC)和p38MAPK抑制剂SB203580对药物诱导的细胞凋亡阻断作用。
结果
1.用不同浓度的BTZ和GNA处理MM.1S和RPMI8226细胞后，细胞在形态学上呈现出了不同程度的改变。CCK-8实验发现BTZ及GNA单药均能抑制MM.1S和RPMI8226细胞的增殖，且呈浓度依赖性；BTZ联合GNA作用于这两组细胞株后，在MM.1S细胞株上可以发现两药存在协同抑制作用的浓度，而在RPMI8226细胞株上却未发现存在协同抑制作用的浓度。在基因组、转录组水平MM.1S与RPMI8226细胞存在的明显差异可以部分解释用药效果的不同。
2.我们根据BTZ及GNA作用MM.1S细胞48h的EC50值及实际与预测协同抑制浓度，分别选择浓度为2.3nMBTZ与0.51μMGNA、4.0nMBTZ与0.90μMGNA进行探索。我们发现，2.3nM及4.0nMBTZ作用于MM.1S细胞48h后，G2/M期细胞的比例分别为27.01±1.80%和31.09±2.16%；0.51μM及0.90μMGNA作用于MM.1S细胞48h后，G2/M期细胞的比例分别为23.19±1.44%和26.68±1.96%；2.3nMBTZ联合0.51μMGNA、4.0nMBTZ联合0.90μMGNA分别作用于MM.1S细胞48h后，G2/M期细胞的比例为31.34±1.81%和19.88±1.89%；而对照组G2/M期细胞只占17.23±1.65%。0.90μMGNA、4.0nMBTZ联合0.90μMGNA分别作用48h后，亚G1期的细胞比例为30.23±0.66%和34.93±3.09%。浓度为2.3nMBTZ、0.51μMGNA、2.3nMBTZ联合0.51μMGNA、4.0nMBTZ、0.90μMGNA及4.0nMBTZ联合0.90μMGNA分别作用于MM.1S细胞48h后，BTZ及GNA能诱导Clv-PARP、p53、Clv-Caspase-3、Bax蛋白水平的上调及Bcl-2的下调(p＜0.05)；与单药组相比，两组联合组Clv-PARP、p53、Clv-Caspase-3蛋白的表达均增加，Bcl-2的表达均下调(p＜0.05)；与单药组相比，2.3nMBTZ联合0.51μMGNA能上调Bax的表达(p＜0.05)。
3.在MM.1S荷瘤鼠模型上，BTZ组的肿瘤抑制率为9.68%，GNA组的肿瘤抑制率为19.35%，联合组的肿瘤抑制率为41.94%。两药对裸鼠主要脏器组织无明显损伤。TUNEL发现空白组肿瘤细胞的凋亡率为2.78±1.93%，BTZ组的细胞凋亡率为52.75±7.80%，GNA组的细胞凋亡率为40.00±7.62%，BTZ联合GNA组的细胞凋亡率为66.75±6.08%；与凋亡细胞极少的对照组相比，治疗组均可诱导肿瘤组织细胞发生凋亡(p＜0.001)，且联合组与单药组相比促进凋亡的能力更强(p＜0.05)。IHC及Westernblot发现，各实验组与空白组相比，凋亡相关蛋白的表达水平均呈现出显著差异(p＜0.05)；与BTZ及GNA单药组相比，联合组能够显著提高Clv-PARP、p53、Clv-Caspase-3和Bax蛋白的表达水平(p＜0.01)，而联合组Ki-67与Bcl-2蛋白的表达水平较各单药组显著降低(p＜0.01)。
4.ROS检测发现4.0nMBTZ作用于MM.1S细胞后ROS水平在12h最高，0.90μMGNA作用于MM.1S细胞后ROS在4h达到高峰，4.0nMBTZ与0.90μMGNA联合给药后ROS在1h就达到高峰。Westernblot发现2.3nMBTZ、0.51μMGNA、2.3nMBTZ联合0.51μMGNA、4.0nMBTZ、0.90μMGNA及4.0nMBTZ联合0.90μMGNA分别作用于MM.1S细胞48h后可明显上调p-p38MAPK蛋白的表达水平，且呈现出剂量依赖性，联合组的作用强于单药组(p＜0.05)。ROS抑制剂NAC和p38MAPK抑制剂SB203580预处理细胞后分别给予浓度为4.0nMBTZ、0.90μMGNA、4.0nMBTZ联合0.90μMGNA作用于细胞48h，BTZ、GNA单药及联合组诱导MM.1S细胞的凋亡率均下降(p＜0.05)。NAC和SB203580预处理后4.0nMBTZ、0.90μMGNA、4.0nMBTZ联合0.90μMGNA作用于MM.1S细胞6h发现，BTZ、GNA及BTZ联合GNA均能显著上调MM.1S细胞内ROS的水平，NAC能阻断BTZ、GNA及BTZ联合GNA诱导的ROS的上调(p＜0.001)，但SB203580却未能阻断BTZ、GNA及BTZ联合GNA诱导的ROS的上调(p＞0.05)。
结论
1.BTZ及GNA均能抑制骨髓瘤MM.1S和RPMI8226细胞的增殖，但仅在MM.1S细胞株发现两药具有协同抑制作用。
2.BTZ、GNA及BTZ联合GNA能使MM.1S细胞发生G2/M期阻滞并诱导早期凋亡。GNA协同BTZ能促进Clv-PARP、p53、Clv-Caspase-3的表达上调及Bcl-2的表达下调，表明内、外源性凋亡通路都参与了GNA协同BTZ诱导的MM细胞的凋亡。
3.BTZ、GNA及BTZ联合GNA可通过诱导肿瘤组织细胞的凋亡来抑制MM.1S荷瘤鼠肿瘤的生长。
4.氧化应激ROS/p38MAPK通路参与了GNA协同BTZ促进MM.1S细胞凋亡的过程。
5.BTZ与GNA组合或许可成为临床上一种非常有前景的MM病人个体化的治疗方案。
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma, MM)是目前血液系统第二大恶性肿瘤。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib, BTZ)是临床上治疗MM的经典药物，但其有限的疗效、继发性耐药及产生的毒副作用等均在一定程度上限制了其在临床上的应用。作为一种廉价、广谱、抗癌效果强且毒副作用小的中药提取物，新藤黄酸(Gambogenic acid, GNA)展现了广阔的抗癌前景。在本研究中，我们拟探讨GNA联合BTZ诱导MM凋亡的相关机制。
方法
用不同浓度的BTZ和GNA处理骨髓瘤细胞株MM.1S和RPMI8226，显微镜下观察细胞形态学上的改变，采用CCK-8法分别检测两种药物对MM.1S和RPMI8226细胞的增殖抑制作用，并结合增殖抑制结果对两组细胞株的基因组及转录组学数据进行分析；采用流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测BTZ、GNA单药或联合在不同浓度的作用下对MM.1S细胞的周期阻滞；Westernblot法检测PARP、p53、Caspase-3、Bax及Bcl-2凋亡相关蛋白的表达水平；建立裸鼠荷瘤模型，取1×107个MM.1S骨髓瘤细胞接种于裸鼠，待裸鼠肿瘤的平均体积达100～250mm3后随机分成4组，分别使用BTZ(0.25 mg/kg/d 1、4、8、11)、GNA(2.0mg/kg，隔天)、BTZ联合GNA(BTZ0.25mg/kg/d1、4、8、11及GNA2.0mg/kg隔天)以及等时等量的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)进行干预，用于评价药物对MM.1S荷瘤鼠的抗肿瘤作用；TUNEL法检测荷瘤组织细胞的凋亡；免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)及Westernblot法检测移植瘤组织细胞生长及凋亡相关蛋白Ki-67、PARP、p53、Caspase-3、Bax及Bcl-2的表达；活性氧(Reactive oxygen species, ROS)试剂盒检测BTZ、GNA单药及两药协同作用于MM.1S细胞后ROS的变化；Westernblot检测在药物作用后p38MAPK及p-p38MAPK蛋白的表达情况；AnnexinV-PI双染结合FCM的方法检测ROS抑制剂N-乙酰基半胱氨酸(N-acetyl cysteine, NAC)和p38MAPK抑制剂SB203580对药物诱导的细胞凋亡阻断作用。
结果
1.用不同浓度的BTZ和GNA处理MM.1S和RPMI8226细胞后，细胞在形态学上呈现出了不同程度的改变。CCK-8实验发现BTZ及GNA单药均能抑制MM.1S和RPMI8226细胞的增殖，且呈浓度依赖性；BTZ联合GNA作用于这两组细胞株后，在MM.1S细胞株上可以发现两药存在协同抑制作用的浓度，而在RPMI8226细胞株上却未发现存在协同抑制作用的浓度。在基因组、转录组水平MM.1S与RPMI8226细胞存在的明显差异可以部分解释用药效果的不同。
2.我们根据BTZ及GNA作用MM.1S细胞48h的EC50值及实际与预测协同抑制浓度，分别选择浓度为2.3nMBTZ与0.51μMGNA、4.0nMBTZ与0.90μMGNA进行探索。我们发现，2.3nM及4.0nMBTZ作用于MM.1S细胞48h后，G2/M期细胞的比例分别为27.01±1.80%和31.09±2.16%；0.51μM及0.90μMGNA作用于MM.1S细胞48h后，G2/M期细胞的比例分别为23.19±1.44%和26.68±1.96%；2.3nMBTZ联合0.51μMGNA、4.0nMBTZ联合0.90μMGNA分别作用于MM.1S细胞48h后，G2/M期细胞的比例为31.34±1.81%和19.88±1.89%；而对照组G2/M期细胞只占17.23±1.65%。0.90μMGNA、4.0nMBTZ联合0.90μMGNA分别作用48h后，亚G1期的细胞比例为30.23±0.66%和34.93±3.09%。浓度为2.3nMBTZ、0.51μMGNA、2.3nMBTZ联合0.51μMGNA、4.0nMBTZ、0.90μMGNA及4.0nMBTZ联合0.90μMGNA分别作用于MM.1S细胞48h后，BTZ及GNA能诱导Clv-PARP、p53、Clv-Caspase-3、Bax蛋白水平的上调及Bcl-2的下调(p＜0.05)；与单药组相比，两组联合组Clv-PARP、p53、Clv-Caspase-3蛋白的表达均增加，Bcl-2的表达均下调(p＜0.05)；与单药组相比，2.3nMBTZ联合0.51μMGNA能上调Bax的表达(p＜0.05)。
3.在MM.1S荷瘤鼠模型上，BTZ组的肿瘤抑制率为9.68%，GNA组的肿瘤抑制率为19.35%，联合组的肿瘤抑制率为41.94%。两药对裸鼠主要脏器组织无明显损伤。TUNEL发现空白组肿瘤细胞的凋亡率为2.78±1.93%，BTZ组的细胞凋亡率为52.75±7.80%，GNA组的细胞凋亡率为40.00±7.62%，BTZ联合GNA组的细胞凋亡率为66.75±6.08%；与凋亡细胞极少的对照组相比，治疗组均可诱导肿瘤组织细胞发生凋亡(p＜0.001)，且联合组与单药组相比促进凋亡的能力更强(p＜0.05)。IHC及Westernblot发现，各实验组与空白组相比，凋亡相关蛋白的表达水平均呈现出显著差异(p＜0.05)；与BTZ及GNA单药组相比，联合组能够显著提高Clv-PARP、p53、Clv-Caspase-3和Bax蛋白的表达水平(p＜0.01)，而联合组Ki-67与Bcl-2蛋白的表达水平较各单药组显著降低(p＜0.01)。
4.ROS检测发现4.0nMBTZ作用于MM.1S细胞后ROS水平在12h最高，0.90μMGNA作用于MM.1S细胞后ROS在4h达到高峰，4.0nMBTZ与0.90μMGNA联合给药后ROS在1h就达到高峰。Westernblot发现2.3nMBTZ、0.51μMGNA、2.3nMBTZ联合0.51μMGNA、4.0nMBTZ、0.90μMGNA及4.0nMBTZ联合0.90μMGNA分别作用于MM.1S细胞48h后可明显上调p-p38MAPK蛋白的表达水平，且呈现出剂量依赖性，联合组的作用强于单药组(p＜0.05)。ROS抑制剂NAC和p38MAPK抑制剂SB203580预处理细胞后分别给予浓度为4.0nMBTZ、0.90μMGNA、4.0nMBTZ联合0.90μMGNA作用于细胞48h，BTZ、GNA单药及联合组诱导MM.1S细胞的凋亡率均下降(p＜0.05)。NAC和SB203580预处理后4.0nMBTZ、0.90μMGNA、4.0nMBTZ联合0.90μMGNA作用于MM.1S细胞6h发现，BTZ、GNA及BTZ联合GNA均能显著上调MM.1S细胞内ROS的水平，NAC能阻断BTZ、GNA及BTZ联合GNA诱导的ROS的上调(p＜0.001)，但SB203580却未能阻断BTZ、GNA及BTZ联合GNA诱导的ROS的上调(p＞0.05)。
结论
1.BTZ及GNA均能抑制骨髓瘤MM.1S和RPMI8226细胞的增殖，但仅在MM.1S细胞株发现两药具有协同抑制作用。
2.BTZ、GNA及BTZ联合GNA能使MM.1S细胞发生G2/M期阻滞并诱导早期凋亡。GNA协同BTZ能促进Clv-PARP、p53、Clv-Caspase-3的表达上调及Bcl-2的表达下调，表明内、外源性凋亡通路都参与了GNA协同BTZ诱导的MM细胞的凋亡。
3.BTZ、GNA及BTZ联合GNA可通过诱导肿瘤组织细胞的凋亡来抑制MM.1S荷瘤鼠肿瘤的生长。
4.氧化应激ROS/p38MAPK通路参与了GNA协同BTZ促进MM.1S细胞凋亡的过程。
5.BTZ与GNA组合或许可成为临床上一种非常有前景的MM病人个体化的治疗方案。