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脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),是由镰刀菌侵染小麦和玉米等谷类作物产生的一种B型单端孢霉烯族类毒素,由于其在食物链中具有高暴露水平和高污染频率的特性已成为全球农业领域的重要问题之一,对人类和动物的健康构成了严重威胁。目前已有很多研究人员通过体外试验发现DON暴露能够引起细胞凋亡和坏死,而关于DON致神经细胞损伤中是否有自噬的参与及其作用尚未见报道。由于海马神经细胞在中枢神经系统中比较集中,且最容易被外界因素影响而受到损伤,故本试验以仔猪海马神经细胞为模型,用不同浓度的DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng/mL)处理细胞24 h后,采用倒置显微镜观察细胞形态学变化;CCK-8试剂盒检测细胞的存活率;ELISA试剂盒检测DON对细胞神经递质和氧化损伤影响;透射电镜观察细胞超微结构以及自噬体、自噬泡和自噬溶酶体的数量;流式细胞术检测细胞凋亡率;GFP-LC3质粒转染以及免疫荧光检测LC3聚点率;qRT-PCR检测自噬与PI3K/Akt/mTOR通路相关基因mRNA表达量以及蛋白免疫印迹技术(WB)检测相关蛋白的表达量;通过添加自噬抑制剂氯喹(CQ)和自噬激活剂雷帕霉素(RAP)探讨自噬对DON诱导仔猪海马神经细胞损伤的影响以及自噬与凋亡的关系。试验结果如下:1.DON对细胞的形态、氧化损伤以及凋亡率的影响:经不同浓度的DON处理细胞24 h,对照组细胞胞体饱满致密,突起明显且交织成网络状,染毒处理组细胞密度逐渐降低,排列稀疏,细胞明显受损且发生皱缩,呈不规则的放射状;与对照组相比,随着DON浓度逐渐增大,处理组细胞的存活率极显著降低(P<0.01);DON促进细胞神经递质5-HT、DA、ACH和GABA的分泌,抑制NE的分泌,升高细胞脂质过氧化指标MDA含量,降低CAT、GSH-Px、SOD活性,T-AOC和NO含量,差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);与对照组相比,染毒处理组细胞凋亡率随DON浓度的增高而极显著上升(P<0.01)。2.DON对仔猪海马神经细胞自噬的影响:透射电镜观察到对照组细胞胞质均匀,DON处理组细胞胞质中空泡的数量逐渐增多,且出现明显的自噬小体、自噬泡和晚期自噬溶酶体结构;GFP-LC3转染发现,对照组细胞内GFP-LC3蛋白呈弥散分布,随着DON浓度的增加,GFP-LC3蛋白开始出现点状分布,且在DON浓度为1 000 ng/mL时绿色荧光蛋白点状分布最明显。免疫荧光检测发现在对照组细胞内有微弱红色荧光且LC3未成点状聚集,在DON攻毒组,不同质量浓度的DON均可引起LC3发生聚点现象,在DON为1 000 ng/mL时LC3点状聚集的细胞数量最多。细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达呈现先上升后下降的趋势,在1 000 ng/mL时,LC3-Ⅱ含量最高,差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)。3.自噬与细胞损伤:与DON处理组相比,通过雷帕霉素促进自噬可显著提高细胞活性(P<0.05),通过氯喹抑制自噬可显著降低细胞活性(P<0.05)。4.PI3K/Akt/mTOR通路与细胞自噬:与对照组相比,随着DON浓度的上升,PI3K,Akt,mTOR,P70S6K基因的表达水平与磷酸化蛋白的表达水平总体呈下降趋势,差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01),说明PI3K/Akt/mTOR信号通路在DON诱导仔猪海马神经细胞自噬中起负调控作用。5.细胞自噬与细胞凋亡:与对照组相比,各处理组细胞凋亡率均显著或极显著升高(P<0.05 或 P<0.01)。1 000 ng/mL DON+RAP 处理组与 1 000 ng/mL DON 处理组相比,凋亡率极显著下降(P<0.01),1 000 ng/mL DON+CQ处理组与1 000 ng/mL DON处理组相比,凋亡率极显著上升(P<0.01)。综上所述,DON对仔猪海马神经细胞具有一定的毒性作用,能诱导细胞发生凋亡和自噬,氯喹抑制细胞自噬可以降低细胞活性,雷帕霉素诱导自噬可以使细胞活性增强,自噬相关基因和蛋白LC3、PI3K、Akt、mTOR、P70S6K参与了 DON诱导仔猪海马神经细胞自噬的调控,同时抑制自噬,细胞凋亡率上升,诱导自噬,细胞凋亡率下降,表明自噬在DON诱导仔猪海马神经细胞损伤方面起到一定的保护作用。